罗哌卡因诱导骨肉瘤细胞MG-63自噬性死亡和促炎因子表达①

刘芳坊 徐国亭 刘彦锋 徐国兴 李海中

（南阳医学高等专科学校第一附属医院麻醉与围手术医学科，南阳 473058）

原发性骨肉瘤是临床较为罕见的一种恶性肿瘤，却是骨肿瘤较常见类型之一，每百万人中约有10例患者被确诊，好发于青少年。骨肉瘤由间质细胞系发展而来，具有较高转移倾向性，因此患者预后较差，病死率较高［1-3］。尽管近年随着医学技术不断发展，新辅助化疗方式引进，使骨肉瘤患者五年生存率由20%提升至65%～75%，但由于化疗耐药现象普遍存在，加之部分化疗药物较严重的副作用，使骨肉瘤治疗效果仍难以达到预期［4-6］。因此，寻找其他安全、有效的抗肿瘤药物已成为当下研究热点。近年研究发现，局麻药物除已知的镇痛、抗心律失常等作用外，还具有减少癌症复发、提高生存率的作用。文献显示，罗哌卡因（ropivacaine，Rop）等局麻药物在一定浓度范围内能抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移，并促进细胞凋亡，但具体作用机制有待进一步探索［7-8］。目前，有关Rop诱导骨肉瘤细胞MG-63自噬性死亡和促炎因子表达及其作用机制的研究较少，因此，本研究选择骨肉瘤细胞MG-63为研究对象，观察Rop对MG-63细胞增殖、细胞凋亡、自噬及促炎因子表达的影响，并探讨其作用机制，以期为骨肉瘤临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料人骨肉瘤细胞株MG-63购自中国科学院（上海）生物化学与细胞生物学研究所；Rop、10%FBS、DEME培养基购自美国Sigma-Aldrich公司；Trizol试剂、Lipofectamine®2000试剂盒购自美国Invitrogen公司；Bradford蛋白定量试剂、Gimsa染色液购自碧云天生物技术研究所；PVDF膜、ECL化学发光显色液购自美国Millipore公司；Annexin VFITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国Bender公司；辣根酶标记羊抗兔IgG（ZB2301）购自北京中杉金桥公司；IL-6、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）ELISA试剂盒购自上海信帆生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将人骨肉瘤细胞MG-63培养于含10%灭活FBS的DMEM培养基，37℃、5%CO2、饱和湿度培养，每2～3 d换液1次传代，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.2 CCK-8实验与分组取对数生长期MG-63细胞，调整细胞密度为2×104个/L，接种于96孔板，边缘孔加入适量无菌PBS，37℃、5%CO2培养过夜，使细胞单层铺满孔底。次日将培养好的MG-63细胞分为11组，每组设6个复孔，分别加入0、0.3、0.6、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L Rop溶液作用24 h，10μl/孔滴加CCK-8溶液，37℃恒温孵育4 h，酶标仪检测各孔450 nm处OD值，重复测定3次取平均值，计算各组细胞增殖抑制率（%）=（1-OD加药组）/OD空白对照组×100%。根据CCK-8实验结果，将MG-63细胞分为4组，分别加入0、0.5、1.0、2.0 mmol/L Rop溶液。

1.2.3 克隆形成实验将各组MG-63细胞以0.25%胰蛋白酶消化、吹打成单细胞悬液，200个/皿分别接种于含37℃预温培养液10 ml的培养皿，十字轻轻晃动使细胞分散均匀，37℃、5%CO2、饱和湿度常规静置培养2～3周，肉眼观察培养皿中出现可见克隆时终止培养，弃上清，PBS清洗2次，加入醋酸/甲醇溶液（1∶3）固定15 min，弃固定液，加入适量Gimsa染色液染色20 min，流水缓慢清洗，空气干燥，计数肉眼可见的克隆数，克隆形成率（%）=克隆数/接种细胞数×100%。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定细胞凋亡调整各组MG-63细胞悬液至1×106个/ml，400μl/孔接种于6孔板，每组设3个复孔，37℃、5%CO2培养24 h，收集各组细胞至离心管，1 000 r/min离心5 min，PBS清洗2次，弃上清，加入试剂盒中缓冲液混匀，再加入5μl Annexin V-FITC/PI溶液混合，4℃避光孵育20 min，BD流式细胞仪检测，Cell-Quest软件分析计算细胞凋亡率，重复试验3次。

1.2.5 细胞自噬免疫荧光检测调整MG-63细胞悬液密度至1×104个/ml，接种于6孔板，板内放置盖玻片，按照Lipofectamine®2000试剂盒说明将绿色荧光蛋白（EGFP）-LC3b质粒转入细胞，24 h后按实验分组进行加药处理，孵育24 h，PBS清洗，Olympus-BX51荧光显微镜观察细胞自噬情况，计数单个细胞自噬点数量，重复试验3次。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达提取培养24 h的各组MG-63细胞总蛋白，Bradford调整各组蛋白浓度一致，SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜，TBST漂洗充分后置于含5%脱脂牛奶的平皿中密封3 h，TBST再次漂洗备用。根据说明书推荐比例加入一抗4℃孵育过夜，次日取出PVDF膜，TBST漂洗3次，加入二抗室温缓慢振荡孵育1 h，洗膜，转至ECL发光液，常规曝光显影，Imaging System软件分析各组条带灰度值，以GAPDH为内参，依据相对灰度值进行统计学分析。

1.2.7 ELISA检测细胞IL-6、iNOS分泌收集培养24 h的各组MG-63细胞培养上清，采用IL-6、iNOS ELISA试剂盒检测各组MG-63细胞IL-6、iNOS分泌，按照试剂盒说明书操作。

1.2.8 半定量RT-PCR检测IL-6、iNOS mRNA表达提取培养24 h的各组MG-63细胞总RNA，NanoDropND-1000分光光度计检测RNA浓度及纯度，留取符合实验要求（浓度≥50 ng/μl，A260/A280≥1.7）的RNA样本用于RT-PCR检测。以18S RNA基因为内参，分析IL-6、iNOS mRNA相对表达，以2-ΔΔCt表示。采用Primer Premier 5.0、DNAstar生物软件分析IL-6、iNOS、18S RNA基因序列设计引物，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 统计学处理采用GraphPad Prism与SPSS22.0软件进行统计学分析，所有结果以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义，至少进行3个独立检验。

2 结果

2.1 Rop对骨肉瘤MG-63细胞的增殖抑制作用CCK-8结果显示，不同浓度Rop（0.3、0.6、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L）处理骨肉瘤MG-63细胞24 h，Rop以剂量依赖方式抑制MG-63细胞增殖，当Rop≥1 mmol/L时，其对骨肉瘤MG-63细胞增殖具有明显抑制作用（P＜0.05，图1）。克隆形成实验结果显示，0.5 mmol/L Rop溶液处理MG63细胞时，细胞克隆形成率与未处理组差异无统计学意义（P＞0.05），而当Rop溶液浓度达到1.0、2.0 mmol/L时，细胞克隆形成率与未处理组间相比明显降低（P＜0.05，图2）。

图1 Rop抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖Fig.1 Rop inhibits proliferation of osteosarcoma MG-63 cells

图2 Rop对骨肉瘤MG-63细胞的增殖抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Rop on proliferation of osteosarcoma MG-63 cells

2.2 Rop诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡不同浓度Rop（0、0.5、1.0、2.0 mmol/L）处理骨肉瘤MG-63细胞24 h，流式细胞术检测早期和晚期细胞凋亡率之和，0.5 mmol/L Rop溶液处理MG-63细胞时，细胞凋亡率与未处理组相比差异无统计学意义（P＞0.05），而当Rop浓度达到1.0、2.0 mmol/L时，细胞凋亡率与未处理组间相比明显升高（P＜0.05，图3）。

图3 Rop诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡Fig.3 Rop induced apoptosis of osteosarcoma MG-63 cells

2.3 Rop对骨肉瘤MG-63细胞自噬的影响不同浓度Rop（0、0.5、1.0、2.0 mmol/L）处理骨肉瘤MG-63细胞24 h，Western blot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达，0.5 mmol/L Rop溶液处理MG63细胞时，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达与未处理组差异无统计学意义（P＞0.05），当Rop达到1.0、2.0 mmol/L时，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达与未处理组间相比明显升高（P＜0.05，图4）。转入绿色荧光蛋白（EGFP）-LC3b质粒后，未处理组仅在个别MG-63细胞的细胞质内见到微小点状凝集荧光，未见明显荧光颗粒形成；0.5 mmol/L Rop处理MG-63细胞时，细胞自噬率与未处理组间差异无统计学意义（P＞0.05），当Rop达到1.0、2.0 mmol/L时，细胞质内荧光颗粒明显增多，细胞自噬率显著升高（P＜0.05，图5）。

图4 Rop对骨肉瘤MG-63细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达的影响Fig.4 Effects of Rop on expressions of LC3Ⅱ/LC3Ⅰand Beclin1 proteins in osteosarcoma MG-63 cells

图5 Rop诱导骨肉瘤MG-63细胞自噬Fig.5 Rop induced autophagy of osteosarcoma MG-63 cells

2.4 Rop对骨肉瘤MG-63细胞促炎因子表达的影响RT-PCR及ELISA检测结果显示，不同浓度Rop（0、0.5、1.0、2.0 mmol/L）处理骨肉瘤MG-63细胞24 h，0.5 mmol/L Rop处理MG63细胞时，IL-6、iNOS mRNA表达及IL-6、iNOS含量与未处理组差异无统计学意义（P＞0.05），当Rop达到1.0、2.0 mmol/L时，细胞IL-6、iNOS mRNA表达及IL-6、iNOS分泌明显降低（P＜0.05，图6）。

图6 Rop抑制骨肉瘤MG-63细胞IL-6、iNOS分泌Fig.6 Rop inhibits IL-6 and iNOS secretions in osteosarcoma MG-63 cells

3 讨论

近年麻醉镇痛药物和肿瘤转移复发的关系引起研究者广泛关注，多种局部麻醉剂对各种肿瘤细胞的抗增殖、促凋亡作用已得到证明，而Rop作为临床常用长效酰胺类局麻药物，其对骨肉瘤MG-63细胞自噬性死亡和促炎因子表达的影响尚未可知［9-10］。

姬宁宁等［11］报道，临床相关浓度（7.5～30μg/ml）Rop能够明显抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖。本研究在骨肉瘤MG-63细胞中发现了类似结论，CCK-8结果显示，当Rop≥1 mmol/L时，其对骨肉瘤MG-63细胞增殖具有明显抑制作用，且在一定浓度范围内呈剂量依赖性，提示一定浓度Rop对MG-63细胞具有一定杀伤作用。本研究选取0、0.5、1.0、2.0 mmol/L 4个浓度用于对MG-63细胞增殖、凋亡及促炎因子表达影响的探究，克隆形成实验发现，与未处理组比较，当使用1.0、2.0 mmol/L Rop处理MG-63细胞时，细胞克隆形成率明显降低，提示Rop≥1 mmmol/L时，其对于MG-63细胞增殖具有良好的抑制作用，与CCK-8实验结果相符。

既往研究显示，Rop不仅能有效抑制多种肿瘤细胞增殖，还能诱导其凋亡［12-14］。WANG等［15］发现，Rop＞1 mmol/L时能显著抑制HCC细胞增殖，并可通过激活caspase-3表达促进HCC细胞凋亡。本研究采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果显示，与未处理组比较，当采用1.0、2.0 mmol/L Rop处理MG-63细胞时，细胞凋亡率显著增高，提示Rop可诱导MG-63细胞凋亡。

自噬指蛋白转换过程中，起管家作用的物质允许细胞清除多余蛋白或受损细胞器。研究认为细胞自噬与神经退行性疾病、肌肉疾病及癌症等生理病理行为密切相关［16］。尽管多数人认为自噬是机体在饥饿、低氧或细胞毒性作用等压力性不利环境下，为提高细胞存活时间而出现的一种保护性机制，通过降解细胞中不需要或已损坏的大分子或细胞器，循环利用降解产物，维持细胞稳态［17-18］。但近年研究发现，过度自噬可能导致细胞死亡［19-20］。目前常将自噬过程分为3个阶段：①营养缺乏、低氧等因素刺激下，自噬体膜脱落并形成杯状双层膜，包绕被降解物；②分隔膜渐渐延伸，完全包绕被降解的胞浆成分，形成自噬体；③溶酶体与自噬体结合形成自噬溶酶体并降解其内成分，循环再利用［21］。LC3作为酵母ATG8基因的哺乳动物细胞同源物，可靶向定位于自噬体膜，参与自噬形成过程［22］。LC3可分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型游离存在于细胞质，当细胞发生自噬时，Ⅰ型LC3被加工并与自噬膜表面磷脂酰乙醇胺结合，形成Ⅱ型LC3，后者始终位于胞内实体膜上。自噬增强时，Ⅰ型LC3表达下降，而Ⅱ型LC3水平上升［23］。为验证Rop在诱导细胞凋亡时有自噬参与，本研究通过荧光显微镜观察细胞内微管结合蛋白LC3荧光颗粒情况，结果显示，未经处理组或0.5 mmol/L Rop处理组MG63细胞鲜有自噬发生，而经更高浓度（1.0、2.0 mmol/L）Rop处理后细胞自噬率显著升高，因此推测Rop诱导的细胞凋亡包含部分自噬性凋亡。为进一步验证上述结论，本研究采用Western blot检测自噬标志蛋白Beclin1表达，并观察自噬相关蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化的比值，结果显示，Beclin1蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明显升高，证实Rop诱导的细胞凋亡形式中确实包含自噬性凋亡。

NO在动物体内既能作为细胞毒性分子，又可作为信息分子，具有损伤和保护双重作用，主要由NO产生量决定；IL-6则是由多种免疫和非免疫细胞分泌的一种有广泛生物学活性的细胞因子，在机体存在炎症反应时诱导肝细胞合成急性反应蛋白，增强宿主自身破坏性炎症。既往研究显示，异氟醚等麻醉药物可能通过减少炎症细胞和促炎细胞因子释放减轻炎症反应［24-25］。目前Rop与促炎细胞因子表达的研究较少，本研究发现，1.0、2.0 mmol/L Rop处理MG-63细胞，IL-6、iNOS mRNA表达及IL-6、iNOS含量明显下降，提示一定浓度Rop可明显下调MG-63细胞IL-6、iNOS mRNA表达，从而减少IL-6、iNOS分泌。

综上所述，Rop对骨肉瘤细胞MG-63细胞增殖具有抑制作用，并能诱导MG-63细胞自噬性死亡，此外，Rop还能通过下调IL-6、iNOS mRNA表达减少IL-6、iNOS分泌。但本研究仅初步探讨了Rop对骨肉瘤MG-63细胞自噬性死亡和促炎因子表达的影响，MG-63细胞自噬性凋亡的靶点及具体信号分子途径有待进一步研究。