lncRNA-MALAT1通过调节SIRT1介导的肝星状细胞活化调控2型糖尿病并发肝纤维化的机制研究①

吴玉婷 徐利芬 杨宇石 李翀瑶 薄 莉（贵州医科大学病理学教研室，贵阳 550004）

糖尿病是最常见的血糖异常升高引起的代谢性疾病，可引起多种慢性并发症，如视网膜病变、神经病变、糖尿病肾病、非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化等［1-2］。高血糖作为糖尿病的重要特征之一，被认为是引起糖尿病并发症特别是肝纤维化的主要原因，但高血糖诱导肝纤维化的具体机制仍不明确［3-4］。深入研究高血糖诱导肝纤维化的分子机制，有助于进一步理解糖尿病并发肝纤维化的病理生理过程，并为其临床干预提供的新的策略和思路［5］。

lncRNA-MALAT1是一种在恶性肿瘤中研究较多的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。其在肿瘤中的作用主要是促进肿瘤的远处转移，近期也有文章报道lnc-MALAT1在高血糖诱导的肾小管上皮损伤中具有重要作用，但其在糖尿病并发肝纤维化中的作用及机制仍然未知［6-8］。本文研究了lnc-MALAT1通过调控SIRT1介导的肝星状细胞活化及纤维化促进糖尿病并发肝纤维化，为深入理解糖尿病肝纤维化的分子机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料lnc-MALAT1过表达质粒、siRNA购自吉凯基因公司；SIRT1过表达质粒购自和元生物；靶向FOXO1的siRNA购自Santa Cruz（sc-35382）；一抗购自Cell Signaling Technology；二抗购自Affinity；所有引物均购自GeneCopoeia。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养肝星状细胞株IG12在90%DMEM+10%FBS的培养基中常规培养。将细胞在无血清培养基中孵育，采用正常葡萄糖（normal glucose，NG，5.5 mmol/L）或高葡萄糖（high glucose，HG，45 mmol/L）处理后模拟糖尿病高血糖环境下肝星状细胞的改变。肝星状细胞与葡萄糖共孵育的时间为48 h。

1.2.2 细胞转染IG12细胞常规培养，在融合度达到50%左右时转染相应质粒或siRNA，转染12 h后换液，48 h后提总蛋白或总RNA进行下一步实验。

1.2.3 Western blot及RNA逆转录实时荧光定量PCR细胞转染后利用RIPA提取总蛋白，加PMSF和磷酸酶抑制剂防止蛋白降解与去磷酸化。蛋白电泳后转膜，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h后辣根过氧化物酶法检测蛋白表达。GAPDH作为Western blot的内参。

细胞转染后采用Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA，再进行荧光定量PCR。以18S RNA为PCR内参。

1.2.4 染色质免疫共沉淀各实验组转染对应的siRNA或过表达质粒后48 h，1%甲醛37℃固定交联10 min，使用超声破碎。去除杂质后，离心取上清为imput，分别加入对应的抗体或IgG对照，4℃颠转过夜。清洗沉淀后65℃解交联过夜。样品加入RNA酶等处理后，用于PCR分析。

2 结果

2.1 高糖环境介导肝星状细胞的活化及向肌成纤维细胞转变在高糖处理48 h后，对HG和NG组进行Western blot，研究结果表明：HG组的α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、波形蛋白（vimentin）、结蛋白（desmin）、胶原蛋白（collagen）Ⅴ等肝星状细胞活化的分子标志物表达明显升高（图1）。提示在高糖压力诱导下，肝星状细胞活化并向“肌成纤维细胞”转变。

图1 高糖处理后肝星状细胞活化Fig.1 High glucose induced activation of hepatic stellate cells

2.2 lnc-MALAT1介导高糖诱导的肝星状细胞活化及向肌成纤维细胞转变结果表明lnc-MALAT1在HG组表达明显升高（图2A）。α-SMA、波形蛋白、结蛋白、胶原蛋白Ⅴ等分子在过表达lnc-MALAT1组的细胞中表达明显升高（图2B）。提示lnc-MALAT1是调控高糖诱导的肝星状细胞活化的重要分子。

图2 lnc-MALAT1介导高糖诱导的肝星状细胞活化Fig.2 High glucose activated hepatic stellate cells via lnc-MALAT1

2.3 lnc-MALAT1调控肝星状细胞活化及向肌成纤维细胞转变的分子机制本研究拟检测lnc-MALAT1是否通过与FOXO1结合促进SIRT1表达，促进TGF-β通路的激活，进而调控肝星状细胞活化及向肌成纤维细胞转变。研究结果表明，在IG12细胞系中过表达lnc-MALAT1，lnc-MALAT1与SIRT1启动子结合增多（图3）。在过表达lnc-MALAT1的基础上，进一步用靶向FOXO1的siRNA敲低FOXO1表达，则lnc-MALAT1与SIRT1启动子结合有所减少（图3）。以上结果表明，lnc-MALAT1与SIRT1启动子区的结合依赖于FOXO1蛋白，验证了上述假设。

图3 lnc-MALAT1通过FOXO1与SIRT1启动子结合促进其表达并激活下游TGF-β通路Fig.3 lnc-MALAT1 binds SIRT1 promoter to FOXO1 to promote its expression and activated down stream TGF-βpathway

本研究通过检测TGF-β通路相关蛋白表达发现，使用siRNA敲低lnc-MALAT1表达可降低SIRT1和TGF-β1表达，降低SMAD2和SMAD3磷酸化水平，但未改变SMAD2、3总蛋白表达。在使用siRNA敲低lnc-MALAT1表达的基础上，使用过表达质粒增加SIRT1的表达则可提高TGF-β1表达，提高SMAD2和SMAD3磷酸化水平，但不改变SMAD2、3总蛋白的表达。以上结果表明，lnc-MALAT1通过与SIRT1启动子结合可提高SIRT1表达，并进一步提高了下游的TGF-β1表达，提高SMAD2和SMAD3的磷酸化水平，激活了TGF-β通路，促进了肝星状细胞纤维化。

3 讨论

糖尿病患者并发肝硬化会造成肝功能下降，导致一系列并发症，缩短患者生存时间［1-3］。而目前糖尿病并发肝硬化的分子机制尚不清楚，限制了临床干预糖尿病并发肝硬化新方法的开发。本研究从高血糖诱导的肝星状细胞活化及纤维化入手，揭示了lnc-MALAT1在高葡萄糖糖诱导下表达升高，通过FOXO1与SIRT1启动子结合，可促进SIRT1表达升高，进而激活下游的TGF-β信号通路，介导肝星状细胞的活化与向肌成纤维细胞转化，最终导致肝纤维化。

糖尿病最重要的病理生理学特征之一是高血糖诱导的一系列以慢性炎症浸润为特征的细胞损伤，包括血管内皮细胞、肾小管上皮细胞损伤等［9-11］。考虑到lnc-MALAT1在高糖诱导的肾小管上皮细胞损失中亦发挥重要作用［8］，lnc-MALAT1在高血糖诱导的其他糖尿病并发症，如糖尿病视网膜病变、神经病变中也可能具有重要作用，但相关研究目前仍是空白。未来的研究可能会进一步阐释其相关作用及机制，并可能作为糖尿病并发症干预的重要靶点，为糖尿病并发症的临床药物及干预策略等开发提供新的思路。

既往关于lnc-MALAT1的研究主要是关注其在各种恶性肿瘤发生发展和转移中的作用，如lnc-MALAT1在乳腺癌中通过结合并抑制转录因子TEAD，抑制其与YAP的相互作用并抑制相关基因的转录，从而抑制肿瘤转移［6］；lnc-MALAT1通过促进EGFL7表 达 促 进 肿 瘤 的 侵 袭 和 转 移［12］；lnc-MALAT1通过激活P13K-AKT通路促进卵巢癌的增殖和转移［13］；高水平表达的lnc-MALAT1在膀胱癌中提示不良预后并促进肿瘤的临床进展和转移［14］。因此，lnc-MALAT1是一个很有前景的肿瘤治疗潜在靶点。有研究表明，糖尿病患者的恶性肿瘤罹患风险远高于非糖尿病患者［15-17］。糖尿病患者额外增加的肿瘤罹患风险可能与糖尿病高血糖诱导的lnc-MALAT1表达升高有关。考虑到lnc-MALAT1在恶性肿瘤和糖尿病肝纤维化和糖尿病肾小管上皮损伤中均具有重要作用，lnc-MALAT1可作为一个共同的干预靶点。抑制lnc-MALAT1可减轻糖尿病肝纤维化和肾小管上皮损伤，并同时抑制恶性肿瘤的发生发展。因此，lnc-MALAT1是一个十分有前景的糖尿病合并恶性肿瘤的干预靶点。

但本研究也存在一些不足之处：①本研究均为体外实验，相关研究的结论均需要进一步在体内实验中进行验证；②本研究的结论仍需要临床标本进行进一步验证；③lnc-MALAT1在其他疾病模型中被发现可作为miRNA海绵吸附miRNA，从而调控下游分子表达，因此lnc-MALAT1调控肝星状细胞活化及2型糖尿病并发肝纤维化仍可能存在其他分子机制，仍需进一步探索验证。

总的来说，本研究发现肝星状细胞中lnc-MALAT1在高血糖诱导下表达升高，并可通过促进SIRT1表达激活TGF-β通路，促进肝星状细胞向成纤维细胞转变，进而促进肝纤维化。