BBOX1-AS1被TFAP4激活从而促进胃癌细胞的增殖和迁移

张 琴 马雨凡 严永峰 张 璐 张亚军（凉山州第一人民医院消化内科，西昌 615000）

胃癌是消化道系统最常见的恶性肿瘤之一，2017年全球累计新增122.1万胃癌患者，86.5万人因胃癌死亡，是癌症相关死亡的第二大原因［1-2］。目前，胃癌的主要治疗手段以手术切除和化疗为主［3］。但胃癌患者的预后依旧很差，并存在复发和转移现象。因此，深入阐明胃癌的发生发展机制，寻找新的治疗策略以改善胃癌患者的治疗和预后具有深刻意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在调控癌症发生发展中发挥重要作用，并可作为多种癌症的潜在治疗靶点［4-6］。BBOX1-AS1是一种新发现的lncRNA，研究发现其能够海绵吸附miR-361-3p促进宫颈癌和结肠癌的发生发展［7-8］；卵巢癌中BBOX1-AS1吸附miR-361-3p可上调PODXL表达，促进卵巢癌的发生发展［9］。但关于BBOX1-AS1在胃癌中的功能和分子机制尚不明确，因此，本研究深入探讨其在胃癌中的分子功能和作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞人正常胃黏膜上皮细胞系GES-1及胃癌细胞系AGS、HGC27、MKN45均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，并在本实验室传代培养。

1.1.2 主要试剂RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；青霉素、链霉素和胰蛋白酶购自武汉普诺赛生命科技有限公司；RIPA细胞裂解液、Trizol裂解液、Lipofectamine 3000转染试剂购自美国Invitrogen公司；cDNA反转录试剂盒、SYBR荧光定量PCR试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；TFAP4过表达载体（oe-TFAP4）、TFAP4干扰序列（si-TFAP4）、BBOX1-AS1干扰序列（si-BBOX1-AS1）及其阴性对照载体（oe-NC、si-NC）、BBOX1-AS1野生型和突变型荧光素酶载体均由上海吉玛生物有限公司构建合成；CCK-8试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；TFAP4、MMP-2、MMP-9及辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG和兔抗GAPDH单克隆抗体购自美国Abcam公司；ECL试剂盒购自中国Solarbio公司。干扰序列如下：si-TFAP4-5'-CAGGAAAACAGAGAAAGAAGTGA-3'；si-BBOX1-AS1#1-5'-TGGTTCTAAAATCTAAAAGAAGA-3'；si-BBOX1-AS1#2-5'-GAGCTATTCCATGTATTCCATGG-3'。

1.2 方法

1.2.1 GEPIA2数据库在线分析通过GEPIA2数据库Expression DIY模块（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#analysis）以ANOVA为 分 析 方 法，|log2FC|＞1，q-value＜0.01为阈值，在线分析BBOX1-AS1在胃癌患者中的表达水平。

1.2.2 细胞培养将人正常胃黏膜上皮细胞系GES-1及胃癌细胞系AGS、HGC27、MKN45培养于含10%（V/V）胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI1640培养基中，在37℃、含5%CO2的恒温培养箱中培养至对数生长期，进行后续研究。

1.2.3 细胞转染取对数生长期的MKN45细胞，以0.8×106个/孔接种于6孔板，待细胞密度达到60%时，根据参考说明书使用Lipofectamine 3000转染siRNA、重组载体和各自对照至MKN45细胞中。

1.2.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）按照试剂盒说明书方案使用Trizol裂解液从细胞中提取总RNA，试剂盒反转录合成cDNA。SYBR荧光定量PCR试剂盒进行qRT-PCR实验。以GAPDH为内参进行归一化处理，结果用2-ΔΔCt值比较对照组和实验组的目的基因相对表达量差异。BBOX1-AS1正向引 物：5'-TGTGTGTTTCCTGAGGCCTC-3'；反 向 引物：5'-CGCCTCTCTTGGAACACCTT-3'；GAPDH正向引物：5'-CCACAGTCCATGCCATCAC-3'；反 向 引物：5'-CGTTCAGCTCAGGGATGAC-3'。

1.2.5 Western blot收集各处理组细胞，用预冷的RIPA裂解液冰上裂解10 min后提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量后，将等量蛋白于100 V下进行SDS-PAGE分离蛋白。之后以60 V、120 min将蛋白迁移至NC膜，一抗4℃孵育过夜，加HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，室温下孵育120 min，然后用ECL试剂盒进行发光反应，拍照观察蛋白印记。

1.2.6 JASPAR预测BBOX1-AS1和转录因子TFAP4的结合位点利用JASPAR数据库（http：//jaspar.genereg.net/search？advanced=true）查询转录因子TFAP4的信息，并导入BBOX1-AS1启动子区序列信息，网站在线预测TFAP4和BBOX1-AS1启动子的结合位点。

1.2.7 荧光素酶实验利用Lipofectamine 3000分别将si-TRAP4、si-NC、oe-TRAP4、oe-NC和BBOX1-AS1野生型和突变型荧光素酶载体共转染至MKN45细胞，转染48 h后采用双荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光素酶活性。

1.2.8 CCK-8实验将MKN45细胞以1×104个/孔接种于96孔板，分别培养24 h、48 h和72 h后，加入CCK-8溶液继续孵育4 h。酶标仪检测450 nm处的吸光度，测定细胞活力。

1.2.9 划痕实验将MKN45细胞以5×105个/孔接种于6孔板，当细胞密度达到80%后，用移液器枪头在6孔板上轻轻划过，PBS洗涤细胞3次，去除游离细胞。加入无血清培养基培养24 h，显微镜下观察并拍照，记录0 h和24 h的细胞迁移情况。

1.3 统计学分析所有实验均进行3次平行实验，并采用GraphPad Prism 8.0进行统计学分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BBOX1-AS1在胃癌组织及细胞系中高表达 GEPIA2数据库在线分析显示BBOX1-AS1在胃癌组织中高表达（图1A，P＜0.05），但其表达水平和胃癌患者预后关系不明显（图1B，P＞0.05）；qRT-PCR结果显示，与正常胃黏膜上皮细胞系GES-1相比，BBOX1-AS1在胃癌细胞系AGS、HGC27、MKN45中均显著高表达（P＜0.001，图1C）。BBOX1-AS1在MKN45细胞系中表达水平最高，因此选择MKN45细胞系进行下一步研究。

图1 BBOX1-AS1在胃癌组织及细胞系中的表达情况Fig.1 Expression of BBOX1-AS1 in gastric cancer tissues and cell lines

2.2 TFAP4调控BBOX1-AS1表达Western blot结果显示，相较于GES-1细胞，TFAP4在胃癌细胞系AGS、HGC27、MKN45中表达均显著上调（P＜0.001，图2A）。分别转染TFAP4过表达载体（TFAP4过表达组）、TFAP4干扰序列（TFAP4抑制组）及其阴性对照至MKN45细胞。Western blot检测TFAP4表达水平，结果表明，与si-NC组相比，TFAP4抑制组TFAP4表达水平显著降低（P＜0.001，图2B）；与oe-NC组相比，TFAP4过表达组TFAP4表达水平显著增加（P＜0.01，图2B）。此外，qRT-PCR结果显示，与si-NC组相比，TFAP4抑制组BBOX1-AS1表达水平显著降低（P＜0.01，图2C）；与oe-NC组相比，TFAP4过表达组BBOX1-AS1表达水平显著升高（P＜0.001，图2C）。以上研究表明TFAP4可能调控BBOX1-AS1的表达。

图2 TFAP4参与调控BBOX1-AS1表达Fig.2 TFAP4 is involved in regulating expression of BBOX1-AS1

2.3 TFAP4激 活BBOX1-AS1转 录JASPAR数 据库在线分析发现TFAP4能够与BBOX1-AS1启动子区724～733位点结合（图3A）。GEPIA2数据库分析显示，TFAP4在胃癌组中高表达（P＜0.05，图3B），但其与患者预后关系不明显（P＞0.05，图3C）；荧光素酶实验发现在BBOX1-AS1启动子野生型中，过表达TFAP4能够增强荧光素酶活性，而抑制TFAP4则减弱荧光素酶活性，差异有统计学意义（P＜0.001，图3D）；在BBOX1-AS1启动子突变组（5'-ATCCGCTGTTCC-3'→5'-GGATAACGAA-3'）中则无上述现象。提示TFAP4和BBOX1-AS1启动子区724～733位点结合并激活BBOX1-AS1转录。

图3 TFAP4激活BBOX1-AS1转录Fig.3 TFAP4 activates transcription of BBOX1-AS1

2.4 抑制BBOX1-AS1表达可抑制胃癌细胞增殖qRT-PCR检测BBOX1-AS1的干扰效率，结果表明，与si-NC组 相 比，si-BBOX1-AS1#1、2组 中BBOX1-AS1表 达 水 平 均 显 著 降 低（P＜0.001，图4A），其中si-BBOX1-AS1#1的表达水平更低，因此选择si-BBOX1-AS1#1进行下一步研究。CCK-8和EDU实验结果显示，与si-NC组相比，si-BBOX1-AS1#1组MKN45细胞增殖能力显著降低（P＜0.001，图4B、C）。提示抑制BBOX1-AS1表达能够抑制胃癌细胞增殖。

图4 抑制BBOX1-AS1表达对胃癌细胞增殖的影响Fig.4 Effect of inhibiting BBOX1-AS1 expression on proliferation of gastric cancer cells

2.5 干扰BBOX1-AS1表达可抑制胃癌细胞迁移划痕实验结果显示，与si-NC组相比，si-BBOX1-AS1#1组细胞迁移能力显著降低（P＜0.001，图5A）。Western blot结果显示，与si-NC组相比，si-BBOX1-AS1#1组MNK45细胞MMP-2、MMP-9表达水平显著降低（P＜0.001，P＜0.01，图5B）。提示干扰BBOX1-AS1表达能够抑制胃癌细胞的迁移。

图5 抑制BBOX1-AS1表达对胃癌细胞迁移的影响Fig.5 Effect of inhibiting BBOX1-AS1 expression on migration of gastric cancer cells

3 讨论

胃癌是世界范围内严重的卫生健康问题，严重威胁人类的生命安全。胃癌患者常在晚期才被诊断出来，导致胃癌患者的治疗效果不甚理想［10］。最近多项研究表明lncRNA在胃癌的发生发展中发挥重要调控作用［11］。lncRNA MAGI2-AS3受BRD4调控，通过海绵吸附miR-141/200a促进ZEB1过表达，进而促进胃癌进展［12］；lncRNA AC093818.1通过表观遗传学促进PDK1表达，加速胃癌转移［13］；BBOX1-AS1在宫颈癌、结肠癌、卵巢癌等癌症的发生发展中发挥重要作用，并可作为结直肠癌的预后标志物［14］，但关于其在胃癌中的研究还尚未见报道。本研究发现BBOX1-AS1在胃癌组织和细胞系中高表达。此外，在胃癌中TFAP4也是重要因子［15］。研究发现TFAP4在胃癌中也高表达。

TFAP4是一个转录因子，在多数恶性肿瘤中异常表达，和肿瘤浸润程度显著相关，并与肿瘤患者的不良预后显著相关［16-17］。有研究发现TFAP4在肝癌中激活Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信号通路促进肿瘤恶性进展［18-19］。并且有研究发现TFAP4能转录激活lncRNA表达，进而调控肿瘤的发生发展，如：TFAP4与LASP1和LINC00520的启动子区结合，转录激活LASP1和LINC00520表达，促进胶质瘤恶性进展［20］；TFAP4能够与lncRNA TRERNA1启动子中的E-box基序结合并激活其转录，进而促进胃癌细胞的迁移和侵袭［21］。此外miR-608通过抑制TFAP4促进阿霉素诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡［22］；miR-302C靶向TFAP4抑制结直肠癌上皮-间充质转化和转移［23］。以上研究表明，TFAP4能够调控lncRNA促进肿瘤恶性进展，且TFAP4能够作为肿瘤治疗的潜在靶标。本研究发现，TFAP4过表达能够上调BBOX1-AS1表达，而抑制TFAP4表达可降低BBOX1-AS1表达。此外，JASPAR数据库和荧光素酶实验证实TFAP4能够激活BBOX1-AS1转录，这与其既往研究结果一致［21］。最后课题组进一步探究BBOX1-AS1在MKN45细胞系中的分子功能，CCK-8和EDU实验证实抑制BBOX1-AS1表达可抑制MKN45细胞增殖能力；划痕实验证实抑制BBOX1-AS1表达可抑制MKN45细胞迁移能力。

综上所述，BBOX1-AS1和TFAP4在胃癌中高表达，TFAP4可与BBOX1-AS1的启动子区结合转录激活BBOX1-AS1表达，进而促进胃癌细胞的增殖和迁移。