青藤碱调控LncRNA BLACAT1对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响

陈 晨 郑润泉 李宗玉（中国人民解放军联勤保障部队第960医院骨科，济南 250031）

骨关节炎是临床上常见的一种慢性疾病，目前尚无骨关节炎有效治疗药物，软骨细胞是关节软骨的主要细胞，其通过维持细胞外基质的产生与酶促降解的平衡而发挥作用，骨关节炎发生过程中可产生软骨细胞生长停滞、细胞损伤等，因而减轻软骨细胞损伤成为重点，研究表明生物碱与植物的活性成分等具有抗氧化、抗炎等作用，并可减轻软骨细胞损伤［1-4］。青藤碱是从中药青风藤中提取的生物碱单体，具有抗炎、镇痛等作用，研究表明青藤碱可减缓类风湿关节炎骨破坏的进程，但其作用机制尚未阐明［5］。LncRNA BLACAT1在骨关节炎骨髓基质干细胞中表达水平升高，并可通过靶向miR-142-5p而抑制细胞增殖［6］。但青藤碱是否可通过调控BLACAT1的表达从而发挥作用尚未可知。因此，本研究采用脂多糖（LPS）诱导软骨细胞建立骨关节炎软骨细胞损伤模型，探讨青藤碱对LPS诱导的软骨细胞增殖、凋亡、炎症反应的影响及其对BLACAT1的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料青藤碱购自湖南正清制药集团股份有限公司；人正常软骨细胞购自北纳生物；IFN-γ、TNF-α检测试剂盒购自北京诺博莱科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000购 自美国Invitrogen公 司；si-NC、si-BLACAT1、pcDNA、pcDNA-BLACAT1购自广州锐博生物科技有限公司；Trizol试剂购自大连宝生物工程有限公司；反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；CCK-8试剂购自日本同仁化学研究所；凋亡检测试剂盒、LPS购自美国Sigma公司；兔抗人Bax、Bcl-2抗体购自美国CST公司；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Bio-Tec ELX808酶标仪购自美国Bio-Tec公司；FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司；StepOnePlus实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组软骨细胞接种于含100 ng/ml LPS的培养液中培养12 h，记为LPS组［7］。同时将正常培养的软骨细胞作为Con组。软骨细胞接种于含不同浓度（20、40、80μg/ml）的青藤碱与含100 ng/ml LPS的培养液中培养12 h，分别记为LPS+青藤碱-L组、LPS+青藤碱-M组、LPS+青藤碱-H组［8］。si-NC、si-BLACAT1分别转染人软骨细胞后加入含100 ng/ml LPS的培养液中培养12 h，分别记为LPS+si-NC组、LPS+si-BLACAT1组。pcDNA、pcDNA-BLACAT1分别转染软骨细胞后加入含80μg/ml青藤碱与100 ng/ml LPS的培养液中培养12 h，分别记为LPS+青藤碱-H+pcDNA组、LPS+青藤碱-H+pcDNA-BLACAT1组。

1.2.2 qRT-PCR检测细胞中BLACAT1的表达水平采用Trizol法提取各组软骨细胞总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度。反转录体系：5×DNA Buffer 2μl、10×King RT Buffer 2μl、FastKing RT Enzyme Mix 1μl、FQ-RT Primer Mix 2μl、RNA（2μg），RNase-Free ddH2O补足体系至20μl；反应条件：42℃15 min，95℃3 min。qRTPCR扩增反应体系：SYBR Green Master Mix 10μl、正反向引物各0.8μl、cDNA 2μl，ddH2O补足体系至20μl；反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循环。BLACAT1以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算BLACAT1相对表达量。

1.2.3 CCK-8实验检测细胞活力收集各组软骨细胞（1×105个/ml）接种于96孔板（100μl/孔），每孔加入10μl CCK-8溶液，将其置于培养箱中继续培养2 h，应用酶标仪检测各孔吸光度值（OD450nm）。

1.2.4 平板克隆形成实验收集各组软骨细胞接种于6孔板（1×103个/孔），将其置于培养箱内继续培养14 d，弃培养基，加入预冷PBS洗涤后加入甲醇（500μl/孔），将其置于-20℃冰箱内孵育20 min，弃甲醇，加入1%结晶紫染色液（400μl/孔）孵育15 min，清洗后晾干，观察细胞克隆形成数。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率收集各组软骨细胞加入预冷PBS洗涤后弃上清，向细胞沉淀中加入500μl结合缓冲液，分别加入5μl Annexin VFITC与5μl PI，室温孵育10 min，应用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 ELISA法检测IFN-γ、TNF-α的水平收集各组软骨细胞培养上清液，采用ELISA法检测IFN-γ、TNF-α水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.7 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达收集各组软骨细胞加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，按照BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，SDSPAGE电泳分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜后使用5%脱脂奶粉封闭2 h，4℃孵育一抗稀释液（1∶1 000）24 h，室温条件下孵育二抗稀释液（1∶2 000）1 h，滴加ECL显影，应用Image J软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学处理采用SPSS21.0统计学软件分析数据，计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 青藤碱对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响与Con组比较，LPS组BLACAT1的表达水平升高（P＜0.05），细胞活力降低（P＜0.05），克隆形成数减少（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05），Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）；与LPS组比较，LPS+青藤碱-M组、LPS+青藤碱-H组BLACAT1的表达水平降低（P＜0.05），细胞活力升高（P＜0.05），克隆形成数增多（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05），Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05），且不同剂量间比较差异具有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 青藤碱对细胞增殖、凋亡的影响Fig.1 Effect of sinomenine on cell proliferation and apoptosis

2.2 青藤碱对骨关节炎软骨细胞中炎症因子的影响与Con组比较，LPS组IFN-γ、TNF-α的水平升高（P＜0.05）；与LPS组比较，LPS+青藤碱-M组、LPS+青藤碱-H组IFN-γ、TNF-α的水平降低（P＜0.05），且不同剂量组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 青藤碱对细胞中炎症因子的影响Fig.2 Effect of sinomenine on inflammatory factors in cells

2.3 干扰BLACAT1对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响与LPS组、LPS+si-NC组比较，LPS+si-BLACAT1组细胞活力升高（P＜0.05），克隆形成数增多（P＜0.05），凋亡率降低（P＜0.05），Bax蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05），见图3。

图3 干扰BLACAT1对细胞增殖、凋亡的影响Fig.3 Effect of interference with BLACT1 on cell proliferation and apoptosis

2.4 干扰BLACAT1对骨关节炎软骨细胞中炎症因子的影响与LPS组、LPS+si-NC组比较，LPS+si-BLACAT1组IFN-γ、TNF-α的表达水平降低（P＜0.05），见图4。

图4 干扰BLACAT1对细胞中炎症因子的影响Fig.4 Effect of BLACAT1 interference on inflammatory factors in cells

2.5 BLACAT1可逆转青藤碱对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响与LPS+青藤碱-H+pcDNA组比较，LPS+青藤碱-H+pcDNA-BLACAT1组细胞活力降低（P＜0.05），克隆形成数减少（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05），Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05），见图5。

图5 BLACAT1可逆转青藤碱对细胞增殖、凋亡的影响Fig.5 Effect of sinomenine on cell proliferation and apoptosis was reversed by BLACAT1

2.6 BLACAT1可逆转青藤碱对骨关节炎软骨细胞中炎症因子的影响与LPS+青藤碱-H+pcDNA组比较，LPS+青藤碱-H+pcDNA-BLACAT1组IFN-γ、TNF-α的水平升高（P＜0.05），见图6。

图6 BLACAT1可逆转青藤碱对细胞中炎症因子的影响Fig.6 Effect of sinomenine on inflammatory factors can be reversed by BLACAT1

3 讨论

青藤碱具有抗炎、改善微循环的作用，并可减轻脑组织损伤［9］。青藤碱可抑制促炎因子的表达水平而改善类风湿关节炎的损伤程度［10］。本研究结果显示，LPS诱导的软骨细胞活力降低，克隆形成数减少，而青藤碱可明显升高LPS诱导的软骨细胞活力，克隆形成数增多，且青藤碱中剂量与高剂量相比具有明显差异，提示青藤碱可促进LPS诱导的软骨细胞增殖及增强细胞克隆形成能力。Bcl-2/Bax比值降低可促进线粒体释放细胞色素C而激活caspase级联反应从而诱导细胞凋亡［11］。本研究结果显示，LPS诱导的软骨细胞凋亡率升高，Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，而青藤碱可明显降低LPS诱导的软骨细胞凋亡率，Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平升高，且青藤碱中剂量与高剂量相比具有明显差异，提示青藤碱可抑制LPS诱导的软骨细胞凋亡从而减轻细胞损伤。本研究结果显示，LPS诱导的软骨细胞IFN-γ、TNF-α的水平升高。与相关文献报道结果相似，进一步研究显示，青藤碱可明显降低LPS诱导的软骨细胞IFN-γ、TNF-α的水平，呈剂量依赖性，提示青藤碱可抑制LPS诱导的软骨细胞炎症反应［12-13］。分析原因青藤碱可能通过增强软骨细胞活力及抑制细胞凋亡而减轻细胞炎症损伤。

本研究结果显示，LPS诱导的软骨细胞中BLACAT1的表达水平升高，而青藤碱可明显降低LPS诱导的软骨细胞中BLACAT1的表达水平，提示青藤碱可能通过下调BLACAT1的表达从而发挥作用。研究表明抑制BLACAT1的表达可减轻神经细胞损伤［14］。本研究结果显示，干扰BLACAT1表达可明显升高LPS诱导的软骨细胞活力，克隆形成数增多，而凋亡率降低，IFN-γ、TNF-α的水平降低，提示干扰BLACAT1表达可促进LPS诱导的软骨细胞增殖及克隆形成，而抑制细胞凋亡及炎症反应。同时本研究采用青藤碱与BLACAT1过表达联合处理LPS诱导的软骨细胞，结果显示，细胞活力降低，克隆形成数减少，而凋亡率升高，IFN-γ、TNF-α的水平升高，提示BLACAT1过表达可明显逆转青藤碱对LPS诱导的软骨细胞增殖、克隆形成、凋亡及炎症反应的作用。分析原因可能为青藤碱通过作用于BLACAT1而达到减轻LPS诱导的软骨细胞损伤的作用，但BLACAT1如何调控miRNA表达及其相关通路而发挥作用仍需进一步验证。

综上所述，青藤碱可通过下调BLACAT1的表达而促进LPS诱导的软骨细胞增殖及增强细胞克隆形成能力，并可抑制LPS诱导的软骨细胞凋亡、炎症反应从而减轻细胞损伤，BLACAT1可能作为青藤碱治疗骨关节炎的潜在靶点，但关于其具体作用机制仍需进一步探究。