心肌缺血再灌注损伤分子机制的研究进展

魏成露，冯庆敏，陈宋程，卓怀蜜，李继科

（海南医学院，海南 海口 571199）

心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤是指缺血心肌恢复血流灌注后，心功能没有改善，反而立即加重的现象［1］。冠状动脉阻塞引起的心肌缺血临床表现为持续剧烈的胸骨后疼痛，导致心肌梗死、休克、心律失常或心力衰竭。早期恢复缺血区血流是最常用的治疗策略，如冠状动脉成形术、经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术，可以恢复心肌的氧和营养供应，挽救缺血心肌，挽救患者生命。Jones 等［2］研究发现，心肌I/R 损伤是导致心肌细胞凋亡的关键因素，也是影响患者预后的重要原因。一些患者不可避免遭受再灌注损伤，表现为持续的心肌细胞死亡、心功能进一步恶化以及较低的长期存活率，严重限制了临床疗效及预后。减少缺血再灌注（I/R）对心肌细胞的损伤，是提高心肌缺血患者的治疗效果，改善患者预后的重要措施。自Jennings 首次报道心肌I/R 损伤以来，心肌I/R 损伤一直是心血管疾病研究的热点［3］。尽管新的治疗方法（溶栓、经皮血管重建术、经皮冠状动脉介入治疗、搭桥术等）取得了成就，但仍然没有办法完全防止再灌注本身造成的额外损害。目前针对临床再灌注损伤的药物治疗措施仍未有明显成效。因此，了解心肌I/R 损伤的潜在分子机制并开发新的治疗策略对预防和治疗心脏I/R 损伤具有重要意义。

1 损伤机制及靶点阻断剂

1.1 过度炎症反应

有效的炎症是宿主抵御损伤和组织修复所必需的。然而，过度或慢性心肌炎症会对心肌造成严重损害，如心肌炎、心肌梗死、I/R 损伤、心力衰竭、主动脉瓣疾病、动脉粥样硬化和高血压。再灌注不可避免地伴随着一种特殊的无菌性炎症，这种炎症已被广泛认为是进一步心肌损伤和功能障碍的主要原因［4］。I/R 的早期阶段以急性炎症反应为主。越来越多的证据表明，I/R 损伤过程中会产生大量的炎性介质和趋化因子。激活白细胞、血小板和血管内皮细胞表达大量的黏附分子，如选择素和整合素，能促进白细胞与血管内皮细胞的黏附和白细胞在血管内的聚集；同时激活的中性粒细胞可以分泌细胞因子，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β 和白细胞介素-6［5］。这些细胞因子在细胞损伤中起着重要作用，比如诱导细胞凋亡，然而炎症反应继续扩大，会对心肌细胞造成进一步的损伤。炎症反应暴露血管内皮细胞黏附分子，增加炎症细胞对血管内皮细胞的浸润，中性粒细胞与血小板进一步聚集并黏附在血管内皮表面，加重血管内皮损伤，出现再灌注无复流，导致组织水肿、血管腔水肿，促进微循环障碍，进一步加重心肌损伤［6］，这可能导致心肌细胞氧化应激反应、代谢功能障碍、心肌细胞变性坏死。

1.1.1 p38 MAPK 信号通路 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）由细胞外信号调节激酶1 和2（ERK1/2）、c-jun 氨基末端激酶（JNK）和p38 组成［7］。研究表明，I/R 损伤产生的活性氧激活了MAPK，导致心肌细胞凋亡和坏死，激活中性粒细胞，增加细胞因子和黏附分子的表达水平，并使胞浆蛋白磷酸化和逆转转录因子，从而加重心肌I/R 损伤。ERK1/ERK2 的激活和p38/JNK 的抑制通过减少氧化应激和炎症以及维持细胞骨架结构来保护心肌免受I/R 损伤［8］。

异氟醚可通过抑制p38MAPK 信号通路，能有效恢复心肌I/R 损伤大鼠的心功能，改善心肌细胞的病理改变，减轻炎症反应，减轻心肌梗死和缺血程度［9］；哌唑嗪可通过刺激ERK 的表达和活性，下调心肌细胞NF-AT、AP-1 和NF-κB 的活性和表达水平，减轻I/R 损伤小鼠心肌细胞的炎症和氧化应激［10］。

1.1.2 PI3K-Akt-mTOR 信号通路 磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路是一条重要的膜受体通路。mTOR 位 于PI3K/Akt 通 路 下 游，受PI3K/Akt 通 路的正调控，减轻心肌I/R 损伤。在心肌缺血再灌注中，PI3K/Akt 通路的激活可以磷酸化mTOR，mTOR 是自噬的关键调节因子，磷酸化mTOR 已被报道可通过减少自噬和促进心脏恢复来保护I/R损伤［11］。

橙皮苷通过激活PI3K/Akt/mTOR 通路抑制自噬，抑制炎症和氧化应激来减轻心肌I/R 损伤［12］；重组人脑利钠肽通过促进PI3K/Akt/mTOR 磷酸化，抑制Jurkat T 细胞增殖，抑制促炎相关基因的表达，减轻I/R 损伤［13］。

1.1.3 TLR4/NF-κB/NLRP3 信号通路 Toll 样受体（TLRs）是外源性病原体的受体，通过免疫细胞启动炎症。活化B 细胞核因子κ 轻链增强子（NFκB）属核转录因子，正常时与抑制蛋白结合于失活状态，对氧化还原反应敏感，是多数调节通路p38、TRAF-IKK、PI3K、p65 等的共同枢纽部分。TLR4的激活促进NF-κB 的升高，NF-κB 调节促炎细胞因子的表达。NLRP3 炎症体是Nod 样受体（NLR）家族的一员，由一个核侧结合的寡聚体结构域样受体（NLRP3）、一个caspase 招募结构域（ASC）和caspase-1 组成。NLRP3 蛋白被聚合并结合到ASC 接头上，从而诱导caspase-1 的易位和激活。此外，激活的caspase-1 负责触发促炎细胞因子分泌成熟形式的分泌物。TLR4/NF-κB 信号通路通过调节促炎细胞因子［14］参与介导炎症反应和心肌I/R 损伤的发病机制。

生物黏附素A 通过负调控TLR4/NF-κB/NLRP3 信号通路抑制炎症反应，从而减轻心肌I/R损伤［6］。

1.1.4 AMPK/JNK/NF-κB 信号通路 腺苷酸活化蛋白激酶（Adenine monophosphate activated protein kinase，AMPK）是由上游激酶如肝激酶B1 通过磷酸化的Tr172 残基被ATP 耗竭激活的，AMPK 通过关闭能量消耗途径和刺激ATP 产生途径（如脂肪酸β 氧化和糖酵解）来响应AMP/ATP 比率的增加［15］。MAPK 中的p38MAPK、ERK 和JNK，被认为是NFκB 的上游因子。在心肌缺氧和复氧应激条件下，AMPK 的激活显著减弱了JNK-NF-κB 信号转导通路，抑制了促炎细胞因子的基因和蛋白水平［16］，保护心肌细胞在缺血和再灌注过程中免受损伤。

AMPK 激动剂二甲双胍通过上调TNF-α和IL-6mRNA，降低JNK 活化及下游NF-κB 活化和炎症反应［16］。

1.1.5 TLR4/TRIF 信号通路 TLR4 转导的富含亮氨酸重复结构域和Toll/IL-1 受体结构域的信号在心肌I/R 损伤时诱导炎症反应中起关键作用。TLR4 与其伴侣分子、辅助受体和接头蛋白结合，在外壳蛋白复合体Ⅱ包被的囊泡中被运输到顺式高尔基体。随后，TLR4 被输出到质膜，在那里它对其配体做出反应，并触发一系列炎症级联反应［17］。脂多糖激活TLR4 可诱导两条信号通路：髓系分化因子88（MyD88）依赖性通路和MyD88 非依赖性通路。TLR4/MyD88 和TLR4/TRIF 分别激活NFκB 和干扰素调节因子3 的转录活性，诱导一系列炎症因子，加重心肌I/R 损伤［18］。

远程缺血预处理和七氟醚预处理协同保护大鼠心肌I/R 损伤部分是通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路实现的［19］。

1.1.6 Toll 样受体9 信号通路 坏死心肌细胞释放的线粒体DNA 可激活TLR9，线粒体DNA 和H/R协同作用通过TLR9 依赖机制诱导NF-κB 活性，消融心肌TLR9 信号通路可减轻炎症反应和心肌I/R损伤，但也有报道称，TLR9 刺激减少了能量底物，增加了AMP/ATP 比值，进而激活了AMP 依赖激酶，从而提高了心肌细胞对缺氧的耐受性，而不会引起典型的炎症反应［20］。

DNase Ⅰ和线粒体靶向核酸内切酶Ⅲ的结合，可以维持缺血心肌细胞线粒体的完整性，减少TLR9 的激活，从而对心肌I/R 损伤产生额外的保护作用［21］。

1.1.7 A20/NF-κB 信号通路 锌指蛋白A20，又称肿瘤坏死因子α 诱导蛋白3，是一种抗炎、NF-κB 抑制和抗凋亡分子［22］。A20 被认为是贯穿心肌缺血/再灌注组织损伤整个病理过程的炎症的关键因素［23］。A20 是NF-κB 的中枢，可诱导的负性调节因子，调节多种炎症信号转导通路。沉默A20 可以显著激活IKK-β，促进NF-κB p65 的易位，IκB-α 磷酸化，中性多形核细胞浸润，心室肌细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1 和诱导型一氧化氮合酶的过度表达，最终导致促炎状态［24］。

银杏内酯B 可通过A20-NF-κB 信号通路使A20 表达增加，改善心肌I/R 损伤大鼠心脏超微结构特征，降低血清炎性细胞因子含量，减轻心肌I/R损伤所致的炎症反应［24］。

1.1.8 PI3K/Akt/HO-1 信号通路 血红素加氧酶（HO-1）是一种重要的抗氧化应激和组织保护酶。当心肌细胞处于氧化应激状态时，核因子E2 相关因子2（Nrf2）被Akt 磷酸化、解离、激活并移位到细胞核，在那里它与抗氧化应激反应元件（ARE）结合，促进HO-1 和SOD 等抗氧化蛋白的表达，以对抗缺血和缺氧引起的氧化应激［25］。HO-1 的基因调控也受到一些Nrf2 抑制子的负调控，如Bach1，而Bach1基因的缺失会导致HO-1 表达的增加。PI3K 是细胞内的磷脂酰肌醇激酶，是位于质膜上的第二信使。Sun 等［26］指 出 抑 制PI3K/Akt 通 路 可 显 著 降 低HO-1 蛋白的表达，从而减弱HO-1 对心肌细胞的保护作用，即PI3K/Akt 上调Nrf2-ARE 途径并介导HO-1 的表达。

银杏叶提取物-761（EGb761）能一定程度地诱导Akt 磷酸化，激活Akt，促进Nrf2 转入细胞核，上调HO-1 的表达，减轻氧化应激和炎症反应，抑制心肌细胞凋亡，保护心肌［27］。

1.1.9 NLRP3 炎症体信号通路 活性氧的形成和氧化应激已被证明是炎症小体激活的重要促进剂［28］。NOX4 是细胞超氧阴离子的来源，已被证明通过调节参与脂肪酸氧化的关键酶肉碱棕榈酰转移酶1A 来介导NLRP3 炎症体的激活［29］。I/R 条件下NLRP3 激活caspase-1，导致促炎细胞因子IL-1β和IL-18 的加工和分泌，加重心肌I/R 损伤。

丙酮酸乙酯可以抑制NLRP3 炎症小体激活，显著减轻心肌I/R 损伤［30］。

1.1.10 Notch1/PTEN/AKT 信 号 通 路 MicroRNA-21（miR-21）是心脏中一种高度特异的miRNA。心肌I/R 损伤导致miR-21 表达显著降低，miR-21 过表达有效抑制心肌细胞凋亡和炎性因子释放［31］。Notch 通路控制miR-21 的表达，心肌缺氧再灌注降低了Notch1 蛋白的表达［32］，从而降低了miR-21 的表达。磷酸酶和张力蛋白同源缺失的第10 号染色体（PTEN）是一种肿瘤抑制基因。PTEN 可以被Notch1 信号负性调节，是AKT 通路的上游和负性调节因子［13］。PTEN/Akt 信号通路在心肌重构、心肌肥厚、心肌纤维化、心肌I/R 损伤中起重要作用［33］。

山奈酚预处理能显著增加H9c2 细胞H/R 过程中miR-21 的表达，通过miR-21 依赖的方式促进Notch1/PTEN/Akt 信 号 通 路，即 促 进Notch1 的 表达，抑制PTEN 的表达，增强Akt 的磷酸化，从而减轻H9c2 细胞的H/R 损伤［32］。

1.2 过量的自由基损伤

在许多以缺血为特征的疾病中，缺氧诱导的氧化应激导致不可逆的损伤。氧化应激可通过细胞内稳态、有丝分裂、细胞分化和细胞内信号转导，导致细胞膜肿胀、破裂或死亡。血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平可反映心肌氧化应激状态，I/R 后血清MDA 含量显著升高，SOD、CAT 和GSH-Px 含量显著降低。

在心肌细胞中，活性氧（ROS）主要由两种途径产生：第1 种途径是通过心肌细胞的线粒体呼吸链消耗大部分的氧气，产生线粒体ROS，并释放大量的ATP 供细胞生命活动；第2 种途径是通过细胞内的 酶 促 反 应 产 生ROS［34］。ROS 包 括 超 氧 阴 离 子（O2·-）、羟自由基（·OH）、过亚硝酸根（ONOODNA）和过氧化氢（H2O2）。正常情况下，细胞利用细胞内ROS 水平的短暂升高作为激活生长和增殖的机制。自由基产生的增加和抗氧化酶活性的降低与心肌I/R 损伤密切相关。在心肌缺血后，心肌组织中便能观察到氧自由基的少量产生，而氧自由基数量的快速增长则发生在再灌注后数秒钟至1 min 以后。活化的中性粒细胞、心肌细胞和血管内皮细胞均可产生并释放氧自由基。缺氧、缺血继发的ATP 缺乏和随后的无氧代谢增加导致细胞pH 下降和细胞内钙超载。在再灌注开始时，细胞内pH 和氧的迅速恢复导致线粒体ROS 生成增加，从而通过氧化作用导致线粒体通透性转换孔开放，DNA 损伤和脂质过氧化进而引起基因突变和细胞死亡［35］。氧自由基过量导致的氧化应激是再灌注损伤的关键因素。

别嘌呤醇、依达拉奉、维生素E、SOD、氨磷汀、二甲双胍、卡维地洛等可减少自由基和抗脂质过氧化。

1.3 钙超载

在心肌I/R 损伤过程中，在没有氧的情况下，细胞代谢转换为无氧糖酵解，导致乳酸积累和胞浆酸化。低pH 和异常的ATP 依赖的泵/交换离子活性导致心肌细胞内钙离子的净积累和活性氧的产生，氧自由基引起心肌细胞膜通透性增加和细胞外钙过量内流，过多的细胞内钙会进入线粒体，导致线粒体钙超载，这会抑制ATP 的产生，阻碍细胞内的信号传递，加剧能量代谢紊乱，并在心肌再灌注时加重［36］。氧自由基还会损害肌质网膜，最终增加细胞内钙水平，进一步加剧钙超载。细胞内钙还能激活一些磷脂酶，主要是蛋白激酶C 和磷脂酶A，破坏细胞膜骨架，同时促使心肌纤维过度收缩，通过Na+/Ca2+交换形成一过性内向电流，在心肌动作电位后形成延迟后除极，引起心律失常。此外，该反应还会产生一些有毒物质，如游离脂肪酸、白三烯、前列腺素和氧自由基［37］。心肌钙超载还会引起冠脉血管和微血管内皮细胞结构和功能的改变，它会引起中性粒细胞的黏附、聚集和浸润，释放一系列炎症因子，并进一步损害心脏血管组织。钙超载引起的能量代谢紊乱也可引起心肌痉挛，并引起病理变化。阻断［Ca2+］i 升高，可减轻或延缓不可逆心肌损伤［38］。

黄芪多糖、腺苷、钙通道阻滞剂可降低心肌细胞内钙水平，从而引发一系列对抗多种疾病的生理效应，临床研究在心肌再灌注时给予钙离子拮抗剂并未取得有益的效果［39］。

1.4 自噬

自噬始于自噬小体的形成，自噬小体是一种网状起源的双层细胞内结构，吞噬细胞质内容物，最终与溶酶体融合以降解物质。在这些新形成的自溶酶体中降解的物质被招募到合成代谢反应中，以维持能量水平，并为合成核酸、蛋白质或细胞器等提供大分子，从而维持细胞新陈代谢、动态平衡和生存［40］。线粒体特有类型的自噬，即有丝分裂吞噬，去除了对细胞有毒并引起免疫反应的受损线粒体。在I/R 损伤中，自噬的激活通过促进缺血时ATP 的生成来帮助维持能量平衡，然后在再灌注阶段切换到清除受损的细胞器和蛋白质，维持再灌注期间的自噬量可减少梗死面积，保护心脏免受I/R损伤［41］。然而，自噬的过度激活也可能通过自噬细胞死亡的过程介导细胞死亡。

1.5 凋亡

细胞萎缩、胞浆密度增加、染色质凝聚、核DNA降解、凋亡小体的形成是凋亡细胞的特征［42］。已知细胞凋亡在心肌梗死后不久被触发，并且在再灌注期间明显增加［43］。Bcl-2 家族蛋白在细胞凋亡调控中发挥重要作用，它包括抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax。Bcl-2/Bax 比值已成为反映细胞凋亡程度的标志物。Caspase-3 是促凋亡蛋白，被认为在细胞凋亡的级联反应中起重要作用，当在细胞凋亡的早期阶段被激活时，它就变成了裂解的caspase-3。近年来，人们已经认识到3 条主要的凋亡信号通路，包括线粒体信号通路、死亡受体信号通路和内质网信号通路。

瑞芬太尼通过抑制Fas/FasL 信号转导通路，减少心肌细胞凋亡，减轻I/R 所致的氧化应激和炎症反应［44］。

2 治疗进展

目前，针对心肌I/R 损伤分子机制的干预方法有缺血预适应、药物性预适应、缺血后适应、药物后处理、远程缺血处理、减轻炎症反应、抗氧自由基、减轻钙超载等的药物干预，以上干预方法未进入临床阶段或临床应用效果不佳。低温靶向体温管理是临床上唯一可以通过上调心脏骤停后存活通路来减轻再灌注损伤的治疗方法［45］，然而，其疗效往往受到以下因素的限制无法在治疗窗口内达到目标体温，且有副作用以及常引起神经预测延迟［46］。

3 总结与展望

心肌I/R 损伤机制复杂，涉及多分子多通路参与，具体机制仍需进一步研究。既往研究已经证实缺氧诱导心肌细胞氧化应激，诱导细胞自噬和凋亡，影响了细胞的存活和生长［47］；复氧可使缺氧引起的H9c2 心肌细胞氧化应激损伤进一步加重，活化ROS/MAPKs 通 路［48］；色 素 上 皮 衍 生 因 子 通 过Fas 增加缺氧时心肌细胞的凋亡，并且色素上皮衍生因子受体在心肌细胞膜上表达［49］。通过研究心肌I/R 损伤机制，更好地了解潜在的信号转导途径，有助于对相关治疗靶点的深入探索，然而目前研究多数局限于动物体内、外实验阶段，其临床效果还有待进一步验证。但随着分子生物学、生物标记技术、纳米技术、蛋白组学、有机化学等多学科发展相互应用，对心肌I/R 损伤分子机制和通路的研究逐渐明了，通路靶点阻断剂的研发即将开拓出新领域。我们期待着心肌I/R 损伤的新疗法的开发，并尽快将其纳入临床试验，以提高急性心梗及心外手术等患者的预后。

作者贡献说明：

魏成露：进行文章的构思与设计，撰写论文并进行论文的修订；冯庆敏、卓怀蜜、陈宋程：是本课题组成员参与了文章的编纂工作；李继科：对文章整体负责、监督管理。