海南番木瓜提取物对D-半乳糖所致衰老模型小鼠抗衰老及学习记忆的影响

2022-09-05熊芸雲周艳宁谢昌材虞道锐

海南医学院学报 2022年16期

熊芸雲，周艳宁，谢昌材，周凯，虞道锐

（1.海南医学院第一临床学院，2.海南医学院基础与生命科学学院，海南海口 571199）

社会生活与经济水平的提高，人口老龄化的日益增加，衰老后带来了许多疾病是现代社会医学所重点关注的问题，至此，当代科学界的热门研究问题之一是探索新的有效抗衰老药物来提高老年人的生活水平［1］。衰老是机体随着增龄各种器官功能的普遍削弱而发生退行性改变，其中涉及了多因素、多器官等复杂过程，它具有慢性的不可逆性特性，导致衰老的主要原因是自由基的产生，氧自由基代谢失衡［2，3］。脑作为人体重要器官，受衰老的影响也非常大，表现为免疫力下降和寿命缩短以及学习记忆能力下降等［4］。虽然目前研究衰老的报道较多，但对于延缓衰老的机制尚未清楚，亦缺乏有效延缓的药物，因此探讨衰老机理及研发有效延缓衰老的药物，从而改善老年人的生活质量具有重要意义［5-7］。

D-半乳糖常用于构建衰老动物模型，其效应已经得到了国内外研究者的认可，并且D-半乳糖已大范围应用于抗衰老药物研究［8］。有文献表明［9］D-半乳糖诱导的衰老模型的程度与16～24 个月大的正常小鼠相似，并且这些变化与自然衰老相一致。番木瓜（Carica papaya）属番木瓜科又称木瓜［10］。主要分布在热带、亚热带［11］。目前有研究表明，番木瓜具有很多生物活性，包括抑菌、抗氧化抗炎、抗菌、抗癌、镇痛等［12-14］。最新研究发现番木瓜具有抗氧化性、能有效地清除自由基等多种生物活性［15］。然而针对海南番木瓜能否延缓衰老的研究进度较为落后，且具体延缓机制尚未明了。因此，本实验以亚急性衰老小鼠模型探索海南番木瓜提取物的抗衰老作用，为海南番木瓜在抗衰老方面提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、药物及仪器

吡拉西坦，批号：190705，购自广东华南药业集团有限公司；D-半乳糖，批号：G0625，购自Sigma 公司；海南番木瓜提取物，由海南医学院生药学教研室提供；用0.9%的NaCl 溶液配置成400、200、100 mg/kg 的药液。3 个剂量组的剂量按市售木瓜粉中人体服用剂量2 倍量递增；［超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT），批号：20180118；一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）批号：20180432、丙二醛（malondialdehyde，MDA）批号：20180275］试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；anti-核因子-E2-相关因子（nuclear factor erythroid-derived factor 2-related fac-tor，Nrf2），批号：ab137550，购自Abcam 公司；Morris 水迷宫装置，购自成都泰盟科技有限公司。生物素化羊抗兔IgG（1∶500），购自Sigma 公司；Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳转印系统，购自Bio-Rad 公司；Western Blot 自动分析仪，购自proteinsimple 公司。

1.2 实验动物

实验小鼠72 只，体重18～25 g，昆明种清洁级，长沙天勤生物技术有限公司购置，各组小鼠均室温分笼喂养，并让其自由饮水进食。本实验动物研究参海南医学院伦理委员会的标准，遵循“3R”实验设计原则，在实验过程中尽可能给动物在舒适的环境中完成，规范操作实验步骤以减轻实验动物的痛苦，实验结束后动物以安乐死的方法处死，最后委托学校动物管理中心处理所有动物尸体。动物合格证号：SCXK（湘）2014-001。

1.3 动物模型的制备及给药

室温下，让小鼠自由饮水、摄食，适应性喂养1周，再通过水迷宫试验［16］先训练后筛选认知功能正常的72 只小鼠作为正式实验。再将其随机分成阳性对照组、阴性对照组、模型组和海南番木瓜提取物高、中、低剂量组，每组12 只小鼠。海南番木瓜提取物高、中、低剂量组（400、200、100 mg/kg）和阳性对照组（600 mg/kg）的小鼠灌胃给药；其余两组灌胃等剂量的0.9%NaCl。同时，阴性对照组腹腔注射给0.9%NaCl 100 mg·kg-1·d-1，其余各组通过腹腔注射给药2%D-半乳糖140 mg/kg。用此方法连续给药进行7 周，每周将进行一次称重，根据体重调整其用药量，7 周后进行后续试验。

1.4 Morris 水迷宫试验

第7 周后小鼠进行2 d 适应性训练，训练内容为将小鼠放置于终点旁水域，小鼠自行找到平台并爬上台阶2 次为准，第3 天开始测试，数据作为记忆成绩。各组小鼠分上、下午两个时间段，大池平均分4 个象征限并标记，将小鼠面向水池壁，且从4 个不同的标记点放入水，同时记录其游泳距离、逃避潜伏期，以90 s 内找到平台为准，若超过90 s 未找到平台，测试者再引导小鼠休息在平台后撤出水池，以90 s 作为其潜伏期。重复实验间隔不少于30 min，连续实验4 d 后撤除平台，接着在任意1 个入水点再让小鼠面向池壁入水，记录其游泳时间［17］。

1.5 小鼠脑组织HE 组织形态学变化

小鼠经Morris 水迷宫实验后，颈椎脱臼处死后取其大脑，脑组织表面少量的血液用冰0.9%NaCl水溶液洗净、滤纸吸干，取出海马组织，将海马组织对半切为两片，将一半海马组织放置于冷冻柜中-80 ℃保存，以备后期Nrf2 蛋白表达测定的使用；另一半则4%甲醛固定，HE 染色观察脑组织形态学变化。剩下的脑组织放置于冷冻柜-20℃保存，用于脑组织SOD、CAT、NOS、MDA 的含量检测。

1.6 小鼠脑组织中SOD、NOS、MDA、CAT 的含量检测

将4 ℃0.9%NaCl 溶液加入事先取材保存的小鼠脑组织，以脑重量体积比1∶9 的量置于匀浆管中匀成浆状，放入低温离心机中，调至4 ℃，离心15 min（转速：3 000 r/min），离心结束后，取出上清液，按说明书进行下一步操作，测其SOD、NOS、MDA、CAT 各自的含量。

1.7 各组小鼠海马组织Nrf2 蛋白表达测定

将保存于-80℃冰箱的另一半海马组织取出后将其剪碎，并按要求将其与RIPA 裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂混合研磨并制成匀浆，低温裂解30 min 左右，下一步离心40 min（转速：12 000 r/min），取其上清液蛋白定量，将计算好的上样量与缓冲液混合、摇匀，100 ℃水煮10 min。上样40 μg 的蛋白样品进行电泳分离，然后转膜封闭1 h，并在4 ℃冰箱中一抗孵育过夜，第2 天二抗37 ℃孵育1 h 于ECL 发光液中显色，结束后进行曝光和拍照，此处利用凝胶图像处理系统处理，最后分析并与内参条带比较灰度值。

1.8 统计学处理

采用SPSS23.0 软件包将本次实验数据进行统计学处理；计量资料的表示采用（±s）；组间差异的比较采用方差分析；两两比较用两独立样本t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况观察

给药第15 天开始，对比模型组和对照组，小鼠的毛色枯黄、无光泽并伴有脱毛，且出现行动迟缓、精神萎靡、摄食明显变小等行为。而第28 天后，海南番木瓜提取物高、中、低各剂量组才出现脱毛现象，但第42 天后脱毛量逐渐减少，且毛色、光泽等方面有很大的改善。

2.2 海南番木瓜提取物对衰老模型小鼠Morris 水迷宫游泳时间的影响

第1 天水迷宫实验中，各组间的游泳时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。从第3 天起，模型组小鼠的游泳时间明显长于阴性对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而海南番木瓜提取物各剂量组与模型组比较，游泳时间均随着实验时间的增加而呈剂量依赖性缩短趋势，第4 天时，海南番木瓜提取物各剂量组比模型组游泳时间明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，吡拉西坦组游泳时间明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.01），但高于高剂量组，提示海南番木瓜提取物在一定范围内提高记忆能力优于吡拉西坦，见表1。

表1 海南番木瓜提取物对衰老模型小鼠水迷宫游泳时间的变化（s，n=12，±s）Tab 1 Effects of hainan papaya extract on swimming time in water maze in aging mice（s，n=12，±s）

注：与阴性对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别剂量(mg/kg)游泳时间第3 天67.31±2.21 79.81±2.29#61.16±3.56*71.36±3.08 59.46±4.35*53.22±4.36*第4 天48.83±2.29 75.72±4.69##39.78±3.07**58.48±4.67*48.19±3.60*35.71±4.78**第2 天72.25±2.42 89.23±3.38 76.42±3.28 75.52±3.82 74.83±3.89 59.29±3.49*阴性对照组模型组吡拉西坦组海南番木瓜提取物组海南番木瓜提取物组海南番木瓜提取物组--600 100 200 400第1 天83.31±2.34 92.88±3.19 85.16±3.50 88.24±2.94 86.52±3.23 81.67±2.86

2.3 海南番木瓜提取物对衰老模型小鼠Morris 水迷宫游泳距离的影响

第1 天水迷宫实验中，各组游泳距离比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。从第2 天起，模型组游泳距离明显长于阴性对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，各海南番木瓜提取物各剂量组的游泳距离均随着实验时间的延长而呈剂量依赖性下降趋势，海南番木瓜提取物高剂量组游泳距离缩短最明显，第4 天时，海南番木瓜提取物中、高剂量组游泳距离明显短于模型组游泳距离，差异具有统计学意义（P＜0.05）；吡拉西坦组也明显缩短，但略高于高剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 海南番木瓜提取物对衰老模型小鼠水迷宫试验游泳距离的变化（m，n=12，±s）Tab 2 Effects of hainan papaya extract on swimming distance of aging model mice in water maze test（m，n=12，±s）

注：与阴性对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别剂量(mg/kg)游泳距离第3 天7.80±1.48 18.81±3.22##11.24±5.38*17.24±5.36 13.24±4.98*8.73±2.87**第4 天6.56±1.43 16.70±3.41##7.67±7.15**17.37±7.45 9.39±4.01*7.11±1.91**第2 天14.71±3.02 20.94±3.54#15.17±4.40 19.82±4.75 16.62±6.60 12.86±5.15*阴性对照组模型组吡拉西坦组海南番木瓜提取物组海南番木瓜提取物组海南番木瓜提取物组--600 100 200 400第1 天19.53±2.85 22.36±4.87 20.34±4.27 20.58±5.12 19.65±3.90 18.58±4.46

2.4 小鼠脑组织中SOD、NOS、CAT、MDA 的含量变化

与阴性对照组比较，模型组SOD、NOS 、CAT含量明显降低，而MDA 含量明显升高，说明模型制备成功。与模型组比较，海南番木瓜提取物各剂量组呈剂量依赖性逆转衰老模型的SOD、NOS 、CAT、MDA 的含量，且随着剂量增加而效果增强，其中高剂量组效果最强，差异均具有统计学意义（P＜0.05），在提升SOD 含量和降低MDA 水平方面优于吡拉西坦组，提示海南番木瓜可能通过调节这两个活性水平来提高学习记忆能力，见表3。

表3 海南番木瓜提取物对衰老模型小鼠脑组织中SOD、NOS、CAT、MDA 含量的影响（n=12，±s）Tab 3 Effects of papaya hainanensis extract on SOD，NOS，CAT and MDA contents in brain tissue of aging model mice（n=12，±s）

注：与阴性对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别剂量(mg/kg)阴性对照组SOD(U/mg)119.48±4.39 NOS(U/mg prot)7.84±0.41 CAT(U/mg)15.56±0.87 MDA(nmol/mg)8.36±1.01模型组--84.67±2.78##3.64±0.41##8.53±0.64##16.65±0.62##吡拉西坦组海南番木瓜提取物组海南番木瓜提取物组600 100 200 146.39±3.56**101.61±4.75*109.82±3.89*6.78±0.54*6.12±0.95*7.37±0.43**16.32±0.65**11.38±0.85*12.63±0.64*10.32±0.66**15.81±0.96 13.72±0.83*海南番木瓜提取物组9.97±0.72**400 135.70±4.92**7.48±0.58**14.49±0.55**

2.5 海南番木瓜提取物对衰老模型小鼠海马组织形态的改变

HE 染色结果中：图1A（阴性对照组）中海马组织可见正常的CA1 区神经细胞，细胞间排列整齐；图1B（模型组）中海马组织可见CA1 区神经细胞变性坏死现象明显，部分细胞的体积变大、胞浆深染，神经元核固缩且轴突消失，细胞膜核膜界限不够清晰且细胞数量有所减少；图1C（吡拉西坦组）中海马组织可见CA1 区神经细胞的形态有好转趋势；图1D（海南番木瓜提取物低剂量组）中海马组织可见CA1 区神经细胞变性、坏死、数量减少，但较模型组轻；图1E、F（海南番木瓜提取物中、高剂量组）中海马组织CA1 区神经细胞变性坏死的程度较轻且数量略减少，细胞膜核膜界限清晰好多，高剂量组较好，其改善程度有一定的剂量依赖性。提示海南番木瓜提取物可能通过保护海马CA1 区神经细胞来延缓衰老和提高记忆。

图1 海南番木瓜提取物对D -半乳糖所致衰老模型小鼠海马组织形态的影响（HE×400）Fig 1 Effects of hainan papaya extract on hippocampal morphology of d-galactose induced aging mice（HE×400）

2.6 海南番木瓜提取物对衰老模型小鼠脑组织Nrf2 蛋白表达的影响

免疫蛋白印迹结果显示，与阴性对照组比较，模型组脑组织中Nrf2 蛋白表达明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，吡拉西坦组脑组织中Nrf2 蛋白表达明显增加（P＜0.01）；而海南番木瓜提取物低、中、高剂量给药组脑组织中Nrf2 蛋白表达均呈剂量依赖性趋势升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且上升幅度与阳性药吡拉西坦组持平。见图2。

图2 海南番木瓜提取物对衰老模型小鼠脑组织脑组织Nrf2 蛋白表达的影响Fig 2 Effects of papaya hainanensis extract on Nrf2 protein expression in brain tissue of aging model mice

3 讨论

目前，老龄化现象逐渐加重，衰老及之后带来的许多问题引起了人们的重视。虽然衰老是一种正常生理现象，但若发展太快，将使NS 带来病理性的如AD、PD 的退行性病变，给患者与其家人造成严重的经济损失［18］。如果长期摄入D-半乳糖，会使代谢紊乱，之后再累及到各器官、系统，使其正常功能降低。包括记忆力减退、免疫器官退化，体力明显不支等症状，而体内无形中有自由基的堆积和过氧化脂质、脂褐质均增高，细胞膜脂质从而受损，继而增高体内的B 型单胺氧化酶活性等。以上的改变都与高龄小鼠类似。

机体内超氧化物歧化酶的活性在衰老中占主要因素，机体随着超氧化物歧化酶活性提升意味着清除自由基的能力会加强。降解产物丙二醛又是在自由基作用下产生的，细胞损伤程度随着MDA含量升高而增大。因此两者含量的多少，直接影响到机体衰老，是衡量衰老的重要指标。本研究结果显示，海南番木瓜提取物各剂量组以一定的趋势提高SOD 活性及降低MDA 水平，这表明其有助于增强机体对自由基的清除能力而大大减少组织细胞损伤程度，因此可能通过其起延缓衰老作用［19，20］。NO 是一种小分子物质，有着多种生物活性，不但提高机体学习记忆能力，而且作用于神经系统介导神经元使氨基酸有兴奋性的反应［21］。本研究结果提示，海南番木瓜提取物各剂量呈剂量依赖性提高NOS 的活性，这进一步表明海南番木瓜可能通过升高体内NOS 活性，使分解出更多的NO 来延缓衰老。过氧化氢酶能清除体内的过氧化氢，阻断产生的一些自由基反应，通过抑制活性氧的产生并堆积来保护身体各脏器由自由基引发的损伤，从而有抗衰老作用［22］。本研究结果表明海南番木瓜提取物各剂量组能够很大程度提高衰老小鼠脑组织中的CAT 的活性，且与吡拉西坦组相当。

反应神经认知和治疗效果评估的水迷宫试验是目前常用的实验手段［23］，本研究结果显示，海南番木瓜提取物各剂量小鼠在逃避潜伏期和游泳探索距离方面有明显的减少，提示海南番木瓜提取物能改善衰老模型小鼠的神经认知功能障碍。小鼠脑海马组织形态学也进一步表明了海南番木瓜提取物高、中、低浓度组都在不同程度上改善神经细胞结构。有研究表明，Nrf2 是抗氧化的因子，其下游的各种抗氧化酶被激活后发挥抗氧化应激损伤，间接延缓衰老［24，25］。本研究结果提示，海南番木瓜能上调Nrf2 蛋白表达的水平，说明间接上调与其相关的抗氧化酶的含量，来增加体内的抗氧化能力，使其能够延缓衰老的效果。

本研究通过海南番木瓜提取物对D-半乳糖所致衰老模型小鼠的干预，发现其具有一定的提高记忆效果，并在一定程度上能改善神经认知功能和海马组织的病理改变，其作用机制可能是有效的提升脑组织中SOD、NOS、CAT 的含量并降低MDA 的水平，进而增加Nrf2 蛋白活性以抗氧化作用去改善小鼠的学习记忆能力，为临床开发用药提供了依据。虽然本实验初步揭示了海南番木瓜提取物在一定程度上能够延缓小鼠衰老并初步探讨了一些其抗衰老的作用机制，但仅仅对动物体内的一些指标，且不够深入、全面的阐释，往后应进一步通过细胞实验以及人体实验来完善，综上，海南番木瓜值得进一步研发。

作者贡献度说明：

熊芸雲：调研整理文献，设计研究方案及论文框架，起草论文；周艳宁、谢昌材、周凯：参与研究，实施研究过程，采集整理数据，统计分析；虞道锐：提出研究选题，获取技术或材料支持，指导性支持。