基于网络药理学和分子对接探讨减味膈下逐瘀汤治疗非酒精性脂肪肝作用机制研究

杨 婧，赵耀伟，牛 捷，王 锐

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150000）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酗酒及其他明确的肝损伤原因而导致的以肝细胞内大量脂肪沉积为主要病理变化的临床综合征，与肥胖、糖尿病等代谢类疾病的发生密切相关。随着饮食习惯的改变，NAFLD 逐渐成为最常见的慢性肝病之一。据全球流行病学调查，NAFLD 在全球的患病率为10%～30%，亚洲国家平均为11%～16%，其中我国的患病率约为15%，且按照现有趋势发展，NAFLD 的发病 年 龄 会 越 来 越 低［1，2］。目 前 临 床 治 疗NAFLD 仍是以增加运动量，改善饮食习惯，控制体重为主，尚无理想药物［3］。

实验研究表明膈下逐瘀汤能够降低NAFLD 模型大鼠血脂和肝脂水平，表明其不仅可以抑制脂质的吸收，还能促进肝脏对脂质的降解代谢［4］，从而缓解脂质堆积对肝脏造成的负担。杨银花等［5］研究发现，血液黏稠度与脂肪肝发生率呈正相关，因此运用膈下逐瘀汤治疗脂肪肝具有丰富理论依据和实际意义。

在临床应用中应准确辨证，依据患者病情进行化裁，才能取得较好临床疗效。临床观察表明经准确辨证，将膈下逐瘀汤进行加减，治疗血瘀痰阻型脂肪肝有效率能够达到92.16%。此外，目前对于NAFLD 的治疗多以降脂、减轻胰岛素抵抗类药物为主，与中药组方的多成分、多通路相比存在一定差距。大多数降脂药物具有促进血液中的脂质进入肝脏代谢排泄的作用，极易导致肝损害和肝脂肪沉积加剧，因此药物选择应更加审慎，相对而言中医药在这方面具有一定优势［6］。

祖国医学认为NAFLD 属“积聚”等范畴，痰、湿、瘀、气滞是NAFLD 发病的关键，病位在肝、脾，证型以实证和虚实夹杂为主，攻补兼施是NAFLD的基本治则［7］。NAFLD 发病过程较为漫长，肝脾两藏功能失司贯穿其整个过程。因此选方用药时应注重顾护肝脾。减味膈下逐瘀汤为我院在临床治疗NAFLD 的常用方，通过对活血祛瘀经典方剂-膈下逐瘀汤进行化裁，删去原方中五灵脂及川芎，重用归肝脾两经的枳壳，改变原方活血逐瘀，破结消积之力较强的特点，依据现代患者多阴血不足的特点，采取顾护肝脾策略，辨证施治，取得较好临床疗效，具有临床推广的价值。减味后全方为“枳壳、赤芍、当归、红花、牡丹皮、桃仁、乌药、香附、延胡索和甘草”。

本研究采用网络药理学方法研究减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 潜在的活性成分和作用靶点，通过构建“成分-靶点-通路”的作用网络关系，以期为减味膈下逐瘀汤的作用机制研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 非酒精性脂肪肝基因数据的差异热图和火山图绘制

Gene Expression Omnibus（GEO）数据库是一个国际高通量实验数据的公共存储库，登录NBCI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）以“Nonalcoholic fatty liver disease”或“NAFLD”作 为 检 索 词 在GEO-DataSets 检索，选定物种为“Homo sapiens（Human）”，通过分析与筛选，获取GSE151158 芯片数据。使用R 软件获取其差异基因，设定Pvalue＜0.005 and |log2（fold change）|＞1，绘制热图与火山图，将疾病的差异基因导入到Excel 表格中，得到其完整的差异基因数据［8］。

1.2 减味膈下逐瘀汤中活性化合物及靶点筛选

中药系统药理学分析平台［9］能够捕捉药物、靶标和疾病之间的关系。将减味膈下逐瘀汤方中诸味药分别提交到数据库中进行筛选，设定筛选条件为OB≥30%和DL≥0.18，其中OB 指药物成分经循环所到达部位及吸收程度和速度；DL 指药物包含一些特定的功能基团或者具有与大多数药物相同或相似的物理特征，这两个指标是筛选药物活性成分的关键参数［10］。将筛选结果导入Drug Bank（https：//go.drugbank.com/），获得活性化合物所对应靶点。

1.3 减味膈下逐瘀汤活性化合物及其靶点与NAFLD 基因网络构建

将差异基因结果与活性化合物对应靶点通过处理取交集，最后应用Cytoscape 作图，得到活性化合物与基因靶点间的关系网络图，进一步确定减味膈下逐瘀汤发挥治疗作用的主要活性化合物及其潜在作用靶点。

1.4 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 基因的PPI 网络构建

研究蛋白之间的相互作用网络，有助于挖掘核心的调控基因。设定DC＞5 和BC＞600，将1.3 筛选结果，录入String 数据库设定物种为“Homo sapiens”，再将经其处理的数据导入Cytoscape 进行可视化处理，最终得到PPI 网络图。

1.5 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 基因GO 生物功能富集分析

GO 是基因本体论联合会所建立的应用于不同物种，对基因和蛋白功能进行限定和描述的数据库［11］，因此将减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 基因进行富集分析，并根据其富集数目、富集显著性绘制柱状图。

1.6 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 基因KEGG 代谢通道富集分析

KEGG 分析能从基因组和分子水平信息中了解生物系统的高级功能和效用，将减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 基因进行富集分析，并进行可视化分析。

1.7 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 通路与基因网络图绘制

将上述KEGG 通路分析结果导入到Cytoscape中，经Degree 处理，显示通路与基因的对应关系，绘制网络图。

1.8 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 成分-基因靶点对接

选取VCAM1、HSPB1、MYC 作为分子对接的靶 蛋 白，并 借 助PDB 数 据 库（https：//www.rcsb.org/），获 取 蛋 白3D 结 构；使 用TCMSP 数 据 库（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）下载活性成分的3D 结构保存为mol2 格式，作为分子对接配体。将上述结果导入SwissDock 平台（http：//www.swissdock.ch/）进行对接。

2 结果

2.1 非酒精性脂肪肝基因差异热图和火山图

将从GEO-DataSets 数据库中检索得到的GSE151158 芯片数据进行处理，共筛选得到63 个样本，使用R 软件获取其差异基因，获得差异基因377个。设 定Pvalue＜0.005 和|log2（fold change）|＞1［8］，进行可视化分析，得到相应热图和火山图。图中横坐标是案例个数，纵坐标是基因或相关名称。红色表示该基因或相关表达明显增加，绿色表示该基因或相关表达降低，黑色则表示在此筛选条件下表达无差异。见图1、2。

图1 正常人与NAFLD 差异基因热图Fig 1 Heat map of differential genes between normal and NAFLD

2.2 减味膈下逐瘀汤活性化合物及靶点

依据OB≥30%和DL≥0.18，筛选得到复方活性化合物如下：赤芍14 个，当归2 个，甘草88 个，红花17 个，牡丹皮6 个，桃仁19 个，乌药9 个，香附16个，延胡索49 个，枳壳5 个，删除重复值筛选得到活性化合物基因307 个。删除重复值后共得到308 个对应靶点。

2.3 减味膈下逐瘀汤活性化合物与NAFLD 基因网络图

将减味膈下逐瘀汤中活性化合物对应靶点与NAFLD 差异基因进行处理，应用Cytoscape 绘图，得到活性化合物与基因间的网络关系图，图3 外圈不同颜色代表了该成分来自于不同药物，内圈代表了药物作用靶点与疾病间的相关基因，网络中的连线表示化合物与基因间存在联系，连线越多则代表该因素越处于核心地位。图示分子MOL000098 对应最多的靶点；PTGS2 为主要作用靶点。见图3。

图3 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 分子基因网络图和活性化合物颜色与对应药物Fig 3 Molecular gene network diagram of Jianwei Gexia zhuyu Decoction in the treatment of NAFLD and active compounds colors and corresponding drugs

2.4 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 基因的PPI网络图

图2 正常人与NAFLD 差异基因火山图Fig 2 Volcano map of differential gene between normal and NAFLD

对减味膈下逐瘀汤的活性成分对应靶点与NAFLD 的差异基因交集结果进行拓扑分析，目的是通过不同的筛选条件，精简PPI蛋白互作网络。主要有两个筛选条件，一是度中心性（degree centrality，DC）＞5，二是中介中心性（betweenness centrality,BC）＞600，通过筛选构建膈下逐瘀汤治疗NAFLD的拓扑网络。拓扑图中最后筛选出的粉色矩形代表主要核心基因即VCAM1、HSPB1、MYC。见图4。

图4 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 基因的拓扑网络Fig 4 Topological network of Jianwei Gexia Zhuyu Decoction for the treatment of NAFLD

2.5 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 基因GO 富集分析图

将减味膈下逐瘀汤中有效活性成分基因进行富集分析，根据基因富集数目与显著程度，选取20条GO 生物过程绘制柱状图，结果显示主要涉及生物过程（BP）中对脂多糖的反应，对细菌源分子的反应和对有机磷的反应等；分子功能（MF）显示主要具有DNA 结合转录激活剂的活性，RNA 聚合酶Ⅱ的特异性，活化转录因子结合，结合蛋白酶等功能。提示减味膈下逐瘀汤对NAFLD 的治疗主要涉及脂质的脂多糖，有机磷的代谢和蛋白质结合和转录等方面。见图5。

图5 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 基因生物过程和基因分子功能Fig 5 Biological process and molecular functionof Jianwei Gexia Zhuyu Decoction for the treatment of NAFLD

2.6 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 基因KEGG 富集分析图

将膈下逐瘀汤中有效活性成分基因进行KEGG 富集分析，结果显示共有60 条通路，根据其富集数目与显著程度绘制的气泡图，见图6。筛选排名前20 条的通路，绘制表格，见表1。结果显示前20 条通路主要包括：IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）、糖尿病并发症中的Wnt 受体信号通路（Wnt signaling pathway）、NF-κB 信 号 通 路（NF-kappa B signaling pathway）、TNF 信 号 通 路（TNF signaling pathway）、AGE-RAGE 信 号 通 路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、C 型凝集素受体信号通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、Toll 样 受 体 信 号 通 路（C-type lectin receptor signaling pathway）等。因此减味膈下逐瘀汤的有效成分可能通过以上这些通路发挥治疗作用。

图6 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 基因KEGG 图Fig 6 KEGG pathway enrichment bubble plot of Jianwei Gexia Zhuyu Decoction Gexia Zhuyu Decoction for the treatment of NAFLD

2.7 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 通路与基因网络图

将上述KEGG 通路导入到Cytoscape 中，根据Degree 值大小，显示通路与基因的富集程度，绘制网络图，见图7。该网络可以反映基因和通路之间的关系，连线说明该基因属于该通路，图形的大小则反映了连接点的数目，连接点越多图形越大。图示hsa04657 是基因对应数目最多的通路，JUN是主要作用基因，具体通路见表1。

表1 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 通路Tab 1 Pathway of Jianwei Gexia Zhuyu Decoction for the treatment of NAFLD

图7 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 通路与基因网络图Fig 7 Pathway and gene network diagram of Jianwei Gexia Zhuyu Decoction for the treatment of NAFLD

2.8 减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 成分-基因靶点对接结果

运用SwissDock 平台将受体与配体进行分对接，对接结果显示，见表2。分子与标靶蛋白的最低结合能均小于0，分子对接的结合能为负表明配体与受体可以自发结合。证明减味膈下逐瘀汤中活性成分与NAFLD 核心基因可以自发结合。其中作为主要活性成分的槲皮素与VCAM1、HSPB1、MYC、JUN 对接结合能分别为：-20.071 2、-27.302 5、-33.264 6、-31.213 2 kJ/mol；黄芩素的对接结合能分别为：-37.609 5、-30.042 0、-40.846 8、-33.432 2 kJ/mol。

表2 槲皮素、黄芩素与疾病核心靶点分子对接结合能（kJ/mol）Tab 2 Molecular docking binding energy of quercetin and baicalein with disease core targets（kJ/mol）

通过Swissdock 对对接结果的可视化处理，如图8 所示，A、B、C 为槲皮素与VCAM1、HSPB1、MYC 对接模式图；D、E、F 为黄芩素与VCAM1、HSPB1、MYC 对接模式图。

图8 分子对接模式图Fig 8 Molecular docking pattern

3 讨论

中医认为痰浊、瘀血、湿热、气滞相互交结形成NAFLD，痰湿、血瘀既是形成本病的主要病理诱因，也是本病论治的关键［12］。临床研究发现，气滞血瘀与气虚血瘀是肝纤维化的主要证型，分别占病例的27%和23%［13］。因此在临床治疗中，治则以活血化瘀、祛湿化痰为主。

膈下逐瘀汤原方具有活血化瘀，行气止痛之功，实验表明高脂饲料诱导的NAFLD 模型大鼠早期出现以血清、肝匀浆ALT、AST 升高的肝功能异常等现象，应用膈下逐瘀汤干预后能够明显改善肝功能状态［14］，此外还能明显抑制由二磷酸腺苷诱导的血小板聚集［15］。活血化瘀方药可改善大鼠早期脂肪肝的肝血流量，抑制血小板聚集，且随着用药时间的延长其抑制作用效果更显著［16］。此外，经膈下逐瘀汤干预后，电镜下显示周胞浆内大小不一的圆形脂滴数量减少，粗面内质网扩张程度，线粒体肿胀扩张和嵴模糊程度均有所减轻［17］。虽然减味膈下逐瘀汤取得较好的临床效果，但是其具体作用成分、靶点及通路尚未明确，现有研究资料较为缺乏，因此本次研究通过网络药理学对其进行分析，筛选复方中有效活性成分，进一步确定其发挥治疗作用的靶点及通路，最终为减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 的临床研究及运用提供依据。

通过筛选减味膈下逐瘀汤得到活性化合物225个，将其与NAFLD 差异基因取交集后得到分子靶点网络，图示有效化合物168 个，对应靶点14 个。多种化合物对应单一靶点，如大多数化合物作用于PTGS2；也存在某一化合物对应多个靶点，如MOL000098-槲皮素、MOL002714-黄芩素，这也从侧面印证了中药复方多靶点的特性。PTGS2 是前列腺素内源性过氧化物合酶PTGS 的异构酶之一，PTGS 及其产物参与炎症反应、凝血平衡等多种生理病理过程［18］。立即早期基因PTGS2的表达对抑制过度纤维化和炎性反应发展有重要作用。当细胞受到相应刺激时，PTGS2的表达迅速上调，进而催化花生四烯酸产生多种前列腺素，产生疼痛、炎性反应以及抗纤维化等作用［19，20］，因此PTGS2 可能是治疗NAFLD 的主要靶点。

槲皮素是一种广泛存在于植物中的天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌等药理作用［21］，可通过抑制肝脏炎症因子的产生、减轻肝细胞的氧化应激、改善胰岛素抵抗、调节肝脏脂质代谢等途径治疗NAFLD［22］；黄芩素是黄芩的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、清除自由基、心脑血管保护等作用，具有肝保护、抗氧化和抗衰老作用，此外实验研究表明黄芩素能明显改善快速老化小鼠模型的肝损伤情况［23］。槲皮素和黄芩素能调节大多数靶点，具有抗炎，调节肝脏脂质紊乱，改善凝血状况和肝损伤等作用，因此其可能是减味膈下逐瘀汤发挥治疗作用的主要化合物。

为进一步确定减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 潜在靶点，将筛选到的14 个靶点进行拓扑分析制作PPI 图，筛选标准分别为DC＞5，BC＞600，得到VCAM1、HSPB1、MYC3 个潜在基因；JUN是富集数目最多的基因。VCAM-1 即血管细胞黏附分子-1，是一种重要的细胞粘附分子，参与免疫细胞的粘附、迁移以及造血细胞的生长发育，此外VCAM-1 不仅可以在IL-1、TNF-α、IFN-γ 等炎性细胞因子的诱导下表达，它的表达也能诱导细胞因子及一些趋化因子的产生［24］；HSPB1 是小分子热休克蛋白亚家族的重要成员，参与调节多种细胞的增殖，分化和细胞凋亡的信号转导，普遍表达于多种组 织 细 胞［25］；MYC基 因 包 括C-myc、N-myc和L-myc，该家族及其产物具有促进细胞增殖、去分化和转化等功能［26］。Jun基因为一类基因家族，包括c-jun、junB和junD。c-jun能够防止肝细胞内质网应激反应过度激活，进而减弱肝细胞损伤与凋亡［27］，因此，以上4 个基因可能是减味膈下逐瘀汤中活性化合物发挥治疗作用的主要靶点。

分子对接验证结果表明，作为主要活性成分的槲皮素与黄芩素均能够和VCAM1、HSPB1、MYC、JUN 取得较好对接结果，证明减味膈下逐瘀汤活性物质可能同这些蛋白结合发挥治疗作用。本文通过对减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 基因进行富集分析，并绘制柱状图及气泡图，根据通路与基因网络图，筛选得DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific，response to lipopolysaccharide 和IL-17 信 号 通 路。

DNA-binding transcription activator activity，RNA polymeraseⅡ-specific 即DNA 结合转录激活因子活性表达和RNA 聚合酶Ⅱ特异性转录。在真核生物中，RNA 聚合酶Ⅱ负责转录数以万计的蛋白质编码基因中的多样化阵列。该过程的控制主要由成千上万的特异性DNA 结合转录因子组成的网络介导，这些转录因子可以解读遗传调控信息，例如转录增强子和启动子中的信息，并将适当的应答传递给RNA 聚合酶Ⅱ转录机制［28］。如肝细胞核因子家族，主要包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6 以及CCAAT/增强子结合蛋白，这一类转录因子主要在肝脏富集表达，相互调控形成了一个复杂的转录调节网，并参与肝脏分化、发育以及维持成熟肝细胞正常功能［29］，参与肝脏的发育、代谢以及功能维持。

Lipopolysaccharide（LPS）即脂多糖，动物实验和人群研究均显示LPS 与NAFLD 的发生、发展有密切关联。进入机体内的LPS 主要在肝脏中解毒，同时LPS 对肝脏也具有毒性作用，主要表现为引起肝脏组织产生大量的活性氧和炎症因子，继而引发肝损伤和炎症反应［30］，与NAFLD 的发生密切相关。

综上所示，减味膈下逐瘀汤中主要有效成分槲皮素、黄芩素通过与VCAM1、HSPB1、MYC、JUN等潜在靶点相互作用，涉及IL-17 信号通路、脂多糖信号转导通路，提示减味膈下逐瘀汤通过减轻炎症反应、调节脂质代谢紊乱、改善凝血状况，干预NAFLD 进程，体现其多靶点、多通路的治疗特性。本文运用网络药理学对减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 的分子机制进行探究，为进一步深入研究减味膈下逐瘀汤治疗NAFLD 作用机制提供理论基础和科学依据。

作者贡献度说明：

本文设计思路由杨婧、王锐教授提供；赵耀伟负责靶点筛选、通路富集、蛋白互作网络构建、分子对接；牛捷负责数据可视化及数据处理。