佐剂性关节炎大鼠miR145-5p/Smads 通路变化、巨噬细胞极化及其相关性分析

范文杰，谌 曦，万 磊，范海霞，刘天阳，李 明，刘 磊，葛 瑶，王晴晴，费陈晨，周 倩

（1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院 风湿科，安徽 合肥 230031）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种自身免疫性疾病，其特征在于滑膜关节的慢性炎症、血管翳形成、进行性骨侵蚀和关节破坏［1］。相关流行病学显示，该病在国内的发病率为0.42%，致残率较高，严重影响患者的生活质量［2］。RA 的发病机制仍不清楚，但大量研究表明与免疫反应造成的关节滑膜炎症有关［3］。巨噬细胞是常见的免疫细胞，通过分泌、吞噬炎症介质参与人体的免疫反应。已有研究表明［4］，RA 疾病发展的过程中有巨噬细胞参与。在不同环境、因素诱导下，巨噬细胞分化成功能不同的具有促炎特性的M1 型巨噬细胞和抗炎特性的M2 型巨噬细胞，这就是巨噬细胞极化现象，巨噬细胞之间的极化失衡可能是RA 疾病发展的重要特征［5，6］，但目前RA 疾病发展过程中巨噬细胞极化失衡的机制仍未明确［7］。研究发现，RA 的巨噬细胞极化可能与microRNA（miRNA）调控紊乱及TGF-β1/Smads 信号通路异常激活有关［8，9］，TGF-β 1/Smads 可通过募集炎性因子、细胞增殖等形式作用于巨噬细胞及免疫细胞等，并以此为靶点促进RA 进展。miRNA 是高度保守的小型非编码RNA，在多种疾病中的作用已得到证实，TGF-β1/Smads 通路参与 RA 巨噬细胞极化可能与miR145-5p 相 关［10］。有 报 道 显 示miR-145-5p 在RA疾病发展过程中起到重要作用，能够调控RA 成纤维样滑膜细胞的增殖和炎症反应，可能是治疗RA的潜在靶点［11，12］。miR145-5p/Smads 信号的异常激活可能影响RA 的炎症进展，但其对巨噬细胞极化的作用机制尚未明确。本研究基于佐剂关节炎大鼠（adjuvantarthritis，AA）模 型，观 察miR145-5p/Smads 信号通路相关因子及M1、M2 巨噬细胞主要标志物IL-8、CD206 表达的相关性来探讨AA 大鼠miR145-5p/Smads 通路与巨噬细胞极化之间的关联。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物安徽医科大学实验动物中心提供的清洁级SD 雄性大鼠12 只，体质量（180±10）g，动 物 许 可 证 号：Lscxk（皖）2017-001。适应性喂养1 周后开展实验。实验得到我院的实验 动 物伦理委员会批准，伦理编号：AHUCM-rats-2021022。

1.1.2主要试剂 IL8、CD206 试剂购自武汉基因美科技有限公司，货号分别为JYM0583Ra、JYM1324Ra。ECL 试剂盒购自美国Therm 公司，货号为340958。弗氏完全佐剂（CFA）购自美国Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1动物分组及造模 使用随机数字表法将12 只清洁级SD 雄性大鼠分为正常组与模型组，每组6 只，喂养1 周后将CFA 0.1 mL 注射于模型组各大鼠右后足跖皮内造模，复制AA 大鼠模型。

1.2.2酶联免疫吸附法检测大鼠膝关节滑膜组织中巨噬细胞极化标志物IL-8、CD206 的表达按照试剂盒说明设置待测样品及空白孔，37 ℃温育30 min，加入显色剂，37 ℃避光显色10 min，用酶标仪检测IL-8、CD206 吸光度，根据标本的标准曲线计算IL-8、CD206 的含量。

1.2.3免疫蛋白印记法检测大鼠膝关节滑膜组织中TGF-β1/Smads 信号通路相关因子的表达 滑膜组织裂解，离心后收集上清液蛋白，加入蛋白上样缓冲液变性，使用SDS-PAGE 加样孔电泳。蛋白使用PVDF 膜转膜后漂洗，使用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。4 ℃孵育山羊抗兔IgG（1∶1 000）过夜，室温孵育山羊抗小鼠（1∶20 000）IgG 1.2 h，洗膜后使用ECL 发光试剂盒检测蛋白。使用Image J 软件解析出目的蛋白灰度值，计算TGF-β1、Smad3、Smad7 相对表达量，并与内参蛋白进行对比。

1.2.4RT-qPCR 检测膝关节滑膜组织中miR145-5p、Smad3、Smad7基因的表达 使用引物见表1，采用Trizol 法提取滑膜巨噬细胞RNA，PCR仪上42 ℃加热2 min，冰浴1 min。加入反应液置于37 ℃，15 min；85 ℃，5 s ，取出反应液（cDNA）作为荧光定量的模板。PCR 扩增条件：95 ℃预变性1 min（1 个循环），95 ℃变性20 s，60 ℃，1 min，40 个循环。PCR 采集内参基因及目的基因的Ct 值，β-actin为 内 参，采 用2-△△Ct 法 计 算miR145-5p、Smad3、Smad7的相对表达量。

表1 miR145-5p 受体及配体引物序列Tab 1 Sequences of miR-145-5p receptors and ligand primers

1.3 统计学处理

采用SPSS23.0 统计软件进行分析处理，计量资料采用（±s）表示，采用两独立样本t检验，相关性分析采用Spearman 分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组滑膜组织中巨噬细胞极化标志物的变化

与正常组比较，模型组滑膜IL-8 表达明显升高，CD206 表达明显降低，模型组巨噬细胞向M1 型极化，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 两组M1、M2 标志物比较（pg/mL ，n=6，xˉ±s）Tab 2 Comparison of markers of M1 and M2 between the two groups（pg/mL ，n=6，xˉ±s）

2.2 两组滑膜组织中TGF-β1/Smads 通路因子的变化

与正常组比较，模型组TGF-β1、Smad3 表达升高，Smad7 表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3 及图1。

表3 两组滑膜中TGF-β1/Smads 通路的变化比较（n=6，xˉ±s）Tab 3 Comparison of changes of TGF-β1/Smads pathway in synovium（n=6，xˉ±s）

图1 两组TGF-β1/Smads 通路的变化Fig 1 Changes of TGF-β1/Smads pathway in the two groups

2.3 两组滑膜组织中miR145-5p/Smads 通路基因表达

与正常组比较，模型组Smad3表达升高，miR145-5p、Smad7表达降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表4。

表4 两组滑膜中miR145-5p/Smads 通路基因变化比较（n=6，xˉ±s）Tab 4 Comparison of changes in miR145-5p /Smads pathway genes in synovium（n=6，xˉ±s）

2.4 两组巨噬细胞极化标志物及miR145-5p 与TGF-β1/Smads 通路因子的相关性分析

通过Spearman 相关性分析得出，M1 巨噬细胞标 志 物IL-8 与Smad3 呈 正 相 关（P＜0.01）、与Smad7 呈负相关（P＜0.05），M2 巨噬细胞标志物CD206 与Smad3 呈负相关（P＜0.01）、与Smad7 呈正相关（P＜0.05），miR145-5p 与Smad3 呈负相关（P＜0.01）、与Smad7 呈正相关（P＜0.01），差异有统计学意义，以上结果表明巨噬细胞M1/M2 失衡与Smad3、Smad7 相 关，Smad3、Smad7 表 达 受 到miR145-5p 调控，见表5。

表5 两组巨噬细胞极化标志物及miR145-5p 与TGF-β1/Smads 通路因子的相关性分析Tab 5 Analysis of macrophage polarization markers and correlation between miR145-5p and TGF-β1/Smads pathway factors

3 讨论

RA 是一种自身免疫介导的慢性关节炎症，伴有骨侵蚀和破坏，常累及多器官系统受损［13］。目前，现代医学并不能达到完全治愈疾病的效果，长期药物治疗的同时通常伴随着严重的副作用［14］。因此，研究RA 进展的关键在于阐明关节软骨破坏和滑膜炎症的发病机制，寻找控制RA 发展的新靶点。

研究表明巨噬细胞极化在RA 疾病进展中起关键作用［15］。极化的M1 型巨噬细胞招募炎性细胞产生炎症介质，包括TNF-α、IL-1、IL-8 等，引发一系列炎症反应，从而加剧关节炎症，极化的M2 巨噬细胞可以分泌抗炎细胞因子，如Arg1、IL-10、VEGF、CD206 等，促进组织修复、免疫调节，从而消除炎症反应。RA 患者滑膜中的巨噬细胞极化程度反映了RA 的疾病程度，M1 巨噬细胞表达于高度活跃的RA 患者体内，而在低活动的患者体内主要表达M2型巨噬细胞［16］。巨噬细胞极化向M1 型分化，细胞分泌的促炎性细胞因子，如TNF-α 和IL-6，除 加剧已有的炎症反应，还能通过诱导破骨细胞分化和抑制细胞增殖并诱导成骨细胞在分化后期凋亡等作用，加重骨侵蚀和关节损伤［17］。

RA 的发病机制与TGF-β1/Smads 信号通路的过激活有关［18］，TGF-β1 具有组织修复和调节免疫反应的能力，在RA 早期会大量聚集在炎症局部，T细胞在其趋化作用下会被快速的募集到炎症部位，使炎性细胞大量增殖出现关节肿大，加重滑膜炎症，加速RA 的病情进程［19，20］。TGF-β1 能通过与跨膜受体激酶结合激活下游信号［21，22］，其主要的下游信号是Smad 家族（Smad1～Smad8）。Ⅰ型TGF-β受体（transforming growth factorβ receptor Ⅰ，TβRⅠ）被TGF-β1 激活后能磷酸化Smad3 蛋白，磷酸化Smad3 蛋白与Smad4 结合并易位到细胞核中，诱导多个靶基因的转录，最终导致RA 关节炎症，而Smad7 能 引 起TβR Ⅰ降 解，从 而 阻 断Smad3 磷 酸化，抑制TGF-β1 传导，阻止炎症对关节持续造成损伤，延缓RA 疾病进展。巨噬细胞在RA 免疫炎症反应过程中起识别、效应作用［23］，既往研究表明，TGF-β1/Smads 信号通路过激活，致使M1/M2 型巨噬细胞平衡失调，巨噬细胞向M1 型分化，分泌更多促炎因子和炎性介质，参与RA 炎症反应，加重骨破坏［24］。有 研究表明，TGF-β1/Smads 通路参与RA巨噬细胞极化可能与miR145-5p 相关［12］。

miRNA 是非编码的单链RNA 家族，约22 个核苷酸，存在于人体多个组织与器官中［25］。miRNA既可以促进炎症发生，也可以通过负反馈回路起作用以限制炎症，在RA 疾病过程中起到重要作用。RA 患者的滑膜及外周血中的miR-145-5p 表达异常，可能是通过影响相关信号通路的激活和炎症因子的分泌，抑制RA 滑膜炎症程度［26-28］。有研究运用荧光素酶测定等方法［29］，验证miR-145-5p 的直接靶基因是Smad3，并且miR-145-5p 抑制了Smad3基因的表达；通过miR-145-5p 和Smad3 的相关性分析，结果表明miR-145-5p 与Smad3 呈现负相关，与Smad7 呈正相关，说明miR-145-5p 可能通过作用于Smad3 调控TGF-β1/Smads 信号通路。通过相关性分析发现巨噬细胞极化M1 标志物IL- 8 与Smad3 呈正相关，与Smad7 呈负相关。M2 标志物CD206 与Smad3 呈负相关，与Smad7 呈正相关，以上结果表明miR145-5p 通过调控TGF-β1/Smads信号通路，调节巨噬细胞极化，抑制体内炎症反应。

综上所述，miR145-5p 可能通过调控Smad3 表达，抑制TGF-β1/Smads 通路过激活，调节巨噬细胞向M2 型极化，参与RA 疾病发展的过程。

作者贡献度说明：

范文杰：进行试验、分析数据、撰写论文；谌曦：设计试验，并对论文提出指导意见；万磊、范海霞、刘天阳、李明、刘磊、葛瑶：参与实验内容及收集数据；王晴晴、费陈晨、周倩：标本采集。