Dectin-2受体介导宿主抵抗烟曲霉菌感染的研究

吴梦雪， 于 垚， 郭 文， 王蓉蓉， 贾鑫明

(同济大学医学院，上海 200092)

Dectin-2(由Clec4n编码)最初鉴定为朗格汉斯细胞特异性C型凝集素受体，随后研究发现在树突状细胞和巨噬细胞中也表达[6-7]。Dectin-2受体能够识别白念珠菌细胞壁表面的α-甘露聚糖成分，激活脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)-核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)通路并促进树突状细胞和巨噬细胞分泌IL-12p40、IL-6等炎症因子来启动宿主天然免疫反应[8]。肺曲霉菌感染患者中肺泡巨噬细胞Dectin-2受体高表达，体外实验发现该受体通过Syk依赖的NF-κB信号通路诱导活性氧的产生，并介导人肺泡巨噬细胞对烟曲霉菌膨胀态分生孢子的杀伤作用[9-10]。但在小鼠肺部感染模型中Dectin-2是否介导宿主抗烟曲霉菌感染是未知的，因此本文通过构建小鼠肺烟曲霉菌感染模型和烟曲霉菌刺激BMDMs的体外炎症模型，探究Dectin-2受体在肺曲霉菌感染过程中的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

本研究使用的烟曲霉菌株AF293为实验室保存菌种，PDA培养基购自明舟生物，胎牛血清和DMEM培养基购自澳洲Gibco公司，链霉素-青霉素双抗(PS)和无菌PBS购自南京维森特生物技术有限公司，TNF-α、IL-12p40和IL-6 ELISA试剂盒购自美国eBioscience公司，10%SDS-PAGE蛋白胶预混液和转膜液购自美国Bio-Rad公司，20×TBS、吐温-20、脱脂奶粉购自上海生工生物工程股份有限公司，ECL化学发光试剂购自上海默克生命科学有限公司，p-IκBα、p-Syk、Syk和GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，HRP标记的鼠抗羊IgG抗体和兔抗羊IgG抗体购自上海艾比玛特生物医药有限公司，37 ℃细胞恒温培养箱、离心机、酶标仪购自美国Thermo Fisher公司，凝胶成像系统购自上海天能公司，垂直板凝胶电泳系统购自美国Bio-Rad公司，组织研磨仪购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2 实验动物

野生型C57雌性小鼠购于上海斯莱克公司，Clec4n-/-小鼠为实验室保存品系，本研究所用小鼠均饲养在同济大学SPF级动物实验中心。

1.3 方法

1.3.1 烟曲霉菌的培养及膨胀态分生孢子的制备 将烟曲霉菌孢子接种于PDA固体培养基上，于37 ℃ 培养箱中培养7 d，将烟曲霉菌分生孢子冲洗刮下，并经70 μm滤器过滤除去菌丝片段，滤液即为烟曲霉菌静息态分生孢子(resting conidia, RC)。将RC置于1640基础培养基中，37 ℃培养6 h，即可得到膨胀态分生孢子(swollen conidia, SC)。

1.3.2 小鼠肺烟曲霉菌感染模型的建立 小鼠经异氟烷麻醉后，将其垂直放置并拉出舌头，用移液枪吸取30 μL包含4×107个烟曲霉菌分生孢子的悬液，紧贴舌根将孢子悬液缓缓滴入小鼠口腔中。小鼠感染2 d后处死，并摘取肺脏进行研磨。将研磨液进行梯度稀释后，吸取100 μL涂布于PDA培养板上，37 ℃培养过夜，统计菌落个数。剩下的匀浆液离心(离心半径8 cm，12 000 r/min，10 min)后取上清液，保存于-20 ℃，用于后续细胞因子的检测。

1.3.3 体外SC刺激 BMDMsWT和Clec4n-/-小鼠骨髓细胞经红细胞裂解液裂解后，加入DMEM培养基(10%FBS+1%双抗+40 ng/mL M-CSF)，置于15 cm 平皿中在37 ℃恒温培养箱培养3 d后，补液10 mL 上述培养基，继续培养3 d后吸去培养基上清液，经Tris-EDTA-Nacl(TEN)缓冲液消化后，用DMEM完全培养基重悬BMDMs并进行计数。将BMDMs以3×106/mL的细胞密度植在12孔板内，并分为对照组、刺激20 min和40 min组。以6×105/mL的细胞密度将BMDMs植在48孔板内，分为对照组和刺激16 h组，每组3个复孔；按照感染复数(multiplicity of infection, MOI)=5向12孔板和48孔板的刺激组中加入经紫外线灭活的烟曲霉菌SC，放置于37 ℃培养箱中进行孵育。

1.3.4 Western印迹法 WT和Clec4n-/-小鼠BMDMs按照1.3.3分组处理后，刺激20 min和40 min 后弃去培养基上清液，加入预冷的含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min，收集细胞上清液，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混匀，95 ℃煮10 min进行变性。每组取10 μL进行SDA-PAGE，电泳结束后将蛋白电转到PVDF膜上，5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，加入p-IκBα(1∶500)，p-Syk(1∶1 000)，Syk(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次后再加入1∶10 000稀释的HRP-羊抗兔/鼠二抗，室温孵育1 h。TBST洗涤3次后经ECL化学发光试剂孵育，凝胶成像系统下成像。

1.3.5 ELISA 按照1.3.3分组处理，刺激16 h后收集48孔板中BMDMs上清液。将细胞上清液和1.3.2中肺脏匀浆液进行适当稀释后，严格按照ELISA试剂盒的使用方法进行TNF-α、IL-12p40和IL-6的检测。用酶标仪测定450 nm处吸光度，根据标准曲线计算出TNF-α、IL-12p40和IL-6的浓度。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 Dectin-2介导烟曲霉菌诱导的NF-κB信号通路的活化

在WT BMDMs中，烟曲霉菌刺激20 min和40 min 后，Syk和IκBα磷酸化水平逐渐增强，NF-κB信号通路被激活，而Clec4n-/-BMDMs中Syk和IκBα的磷酸化水平显著降低，差异具有统计学意义，见图1A、B。表明Dectin-2受体介导烟曲霉菌诱导的Syk依赖性NF-κB信号通路的活化。

图1 Dectin-2缺失对BMDMs NF-κB通路的影响Fig.1 The effect of Dectin-2 deficiency on NF-κB pathway in BMDMsA: Western印迹法；B、C: p-Syk、p-IκBα定量分析；*P<0.05，****P<0.000 1

2.2 Dectin-2介导烟曲霉菌诱导的促炎细胞因子分泌

BMDMs在未刺激时分泌低水平的细胞因子，烟曲霉菌刺激16 h后，WT BMDMs产生高水平的IL-6、TNF-α和IL-12p40，和WT BMDMs相比，Clec4n-/-BMDMs产生的细胞因子水平显著降低(P分别为0.004 2、0.001 9和P<0.000 1)，差异具有统计学意义，见图2。表明Dectin-2受体参与介导烟曲霉菌诱导的BMDMs炎症因子分泌。

图2 Dectin-2缺失对BMDMs细胞因子分泌的影响Fig.2 The effects of Dectin-2 deficiency on cytokine secretion in BMDMsA: IL-6；B: TNF-α；C: IL-12p40；**P<0.01，****P<0.000 1

2.3 Dectin-2缺失增加小鼠对烟曲霉菌的易感性

烟曲霉菌感染2 d后，Clec4n-/-小鼠肺脏荷菌量显著高于WT小鼠(P=0.003 2)，且差异具有统计学意义，见图3。结果说明Dectin-2受体缺失增加了小鼠对烟曲霉菌的易感性。

图3 Dectin-2缺失对小鼠肺脏荷菌量的影响Fig.3 The effect of Dectin-2 deficiency on fungal burdens of lungs in mice**P<0.01

2.4 Dectin-2缺失降低小鼠肺脏促炎细胞因子产生

WT和Clec4n-/-小鼠在未感染状态下肺脏匀浆液中IL-6和IL-12p40水平较低，感染烟曲霉菌后，Clec4n-/-小鼠肺脏匀浆液中IL-6(P=0.008 8)和IL-12p40(P=0.001 7)的水平显著低于WT小鼠，具有统计学意义，见图4A、B。结果表明Dectin-2缺失降低了小鼠肺脏中促炎细胞因子的产生。

图4 Dectin-2缺失对小鼠肺脏细胞因子的影响Fig.4 The effect of Dectin-2 deficiency on cytokine production of lungs in miceA: IL-6；B: IL-12p40；**P<0.01

3 讨 论

Dectin-2是CLRs中的 Ⅱ 型跨膜受体，主要分布于髓系细胞表面[11]。研究表明Dectin-2能够识别白念珠菌、马拉色菌等多种真菌α-甘露聚糖和α-1，2-甘露糖残基[12-13]。烟曲霉菌细胞壁中存在两种甘露聚糖结构，分生孢子和菌丝体中都存在半乳甘露聚糖，而半乳糖胺半乳聚糖仅存在于菌丝体细胞壁中[14-15]，因此Dectin-2可能识别烟曲霉菌。本研究发现Dectin-2缺失降低了烟曲霉菌膨胀态分生孢子诱导的IL-6、TNF-α和IL-12p40的分泌，并降低NF-κB信号通路的活化。Dectin-2通过偶联FcRγ启动下游转导信号，活化Syk后进一步诱导胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain protein 9, CARD9)、B细胞淋巴瘤因子(B-cell lymphoma 10, BCL10)和黏膜相关淋巴组织蛋白1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1, MALT1)形成三元复合物，从而激活NF-κB促进炎性细胞因子和趋化因子的产生[16]，另外Dectin-2还以CARD9非依赖方式激活细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)信号途径介导抗真菌免疫[17]。以往结果发现Dectin-2通过Syk-磷脂酰肌醇3-激酶(phosphati-dylinositol 3-kinasePI3K)-CARD9信号通路介导树突状细胞吞噬新型隐球菌[18]。Dectin-2还能识别荚膜组织胞浆菌触发Syk-C-Jun氨基酸末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信号通路以激活NLRP3炎性体和IL-1β释放[19]。因此，本课题组后续将会探究烟曲霉菌刺激后Dectin-2缺失对ERK、JNK等信号通路影响。

Dectin-2缺失使小鼠感染白念珠菌后生存率显著下降，但不影响宿主对隐球菌感染的防御能力[8,20]。研究发现在小鼠真菌性角膜感染模型中，Dectin-2缺失不影响宿主对烟曲霉菌的清除能力[21]。不同的是，在本研究发现Dectin-2缺失使小鼠对烟曲霉菌肺部感染易感性显著增高，肺脏中促炎因子IL-6和IL-12p40显著降低。和本次研究结果一致的是，在侵袭性曲霉菌病患者中发现了Dectin-2的纯合缺失突变，导致该患者外周血单个核细胞受烟曲霉菌刺激后，IL-6和TNF-α的分泌发生缺陷[22]。靶向递送包被Dectin-2蛋白胞外段的抗真菌脂质体，对侵袭性肺曲霉菌病有很好的治疗作用[23]。另外，研究发现Dectin-2介导人浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)识别烟曲霉菌，Dectin-2抗体阻断能够降低烟曲霉菌刺激的pDC中TNF-α和IFN-α的产生及抗真菌活性[24]。以上结论更加佐证了Dectin-2在肺烟曲霉菌感染中具有重要作用。但Dectin-2在曲霉菌性角膜炎和肺部感染模型中发挥作用并不相同，这提示着Dectin-2在不同感染模型中作用机制可能存在差异。

本研究发现Dectin-2参与介导烟曲霉菌诱导的细胞因子分泌，但是Dectin-2受体缺失的BMDMs并没有完全丧失分泌促炎细胞因子的能力，提示Dectin-2不是唯一参与识别烟曲霉菌的受体。除了研究最为广泛的Dectin-1受体，其他CLRs也被报道参与到烟曲霉菌感染免疫中。DC-SIGN受体介导肺泡巨噬细胞和烟曲霉菌分生孢子的结合和内吞，但DC-SIGN敲低并不影响烟曲霉菌胚芽管刺激后未成熟树突状细胞TNF-α和IL-12的表达[25-26]。这些发现可能反映了固有免疫细胞对不同形态烟曲霉菌的响应机制存在差异。MBL受体可以和烟曲霉菌分生孢子结合，并且用重组人MBL治疗可提高小鼠侵袭性肺曲霉菌病模型中的存活率，增强了促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的产生[27-28]。在大鼠烟曲霉菌角膜炎模型中，Mincle受体在感染早期表达上调，并抑制了烟曲霉菌角膜炎中性粒细胞和巨噬细胞的凋亡[29-30]。另外，在白念珠菌感染中Dectin-3缺失BMDMs中IL-6、TNF-α等促炎因子分泌减少，NF-κB激活水平降低，Dectin-2和Dectin-3 受体还能够形成二聚体协同发挥抗白念珠菌感染作用[31]，但关于Dectin-3在烟曲霉菌感染中的研究还未有所报道。

总之，本研究发现在BMDMs中，C型凝集素受体Dectin-2激活烟曲霉菌诱导的NF-κB信号通路并介导促炎细胞因子的产生，在肺烟曲霉菌感染疾病中发挥重要作用。