氯硝柳胺抑制紫杉醇耐药性三阴性乳腺癌效果及作用机制的实验研究

叶玉萍 林崇峰 郑楠

乳腺癌是当前女性中发病率第一位的恶性肿瘤，2018年，全球有200万例乳腺癌被确诊[1]。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是乳腺癌中最具侵袭性的组织学亚型，其对化疗的反应小，总体预后不良，缺乏常规的靶向治疗方法[2-3]。当前乳腺癌的治疗策略包括手术切除、放疗、化疗等。然而，化疗和放疗存在严重的不良反应，会降低患者的生活质量[4]。较多的乳腺癌患者对紫杉醇初始化疗没有反应，或者在随后的治疗中发生获得性耐药和交叉耐药，患者预后较差，死亡率较高[5-7]。因此，探寻TNBC的新疗法、增效剂或者辅助药物联合治疗以提高疗效意义重大。

研究发现，在耐药性结肠癌细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3-kinase,PI3K）途径被异常激活，且与耐药细胞的恶性侵袭表型有关[8]。在TNBC中，PI3K相关信号通路可以通过受体酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinase,RTK）信号传导在细胞生长和存活的调节之间发挥重要作用[9-10]。PI3K下游最相关的节点是蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）和哺乳动物雷帕霉素靶标蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR），该途径受多种磷酸酶的调节，包括磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN）以及ⅡB型肌醇多磷酸-4-磷酸酶（inositol polyphosphate 4-phosphatasetypeⅡ,INPP4B），从而驱动肿瘤的发展和对化疗的抵抗[11]。有研究指出，常用抗寄生虫药物氯硝柳胺具有一定的抗肿瘤活性，可以保护机体免受致癌因素的损伤，同时可抑制肾癌的侵袭和迁移[12]，其作用机制可能与氯硝柳胺通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导癌细胞凋亡有关[13]。氯硝柳胺是否可以抑制紫杉醇耐药性TNBC的发展以及其作用机制均尚未清楚。基于此，本研究通过细胞和动物实验来探讨氯硝柳胺抑制紫杉醇耐药性TNBC的效果，并分析可能的作用机制，以期为临床治疗TNBC提供参考，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 紫杉醇耐药性TNBC细胞株MDA-MB-231购自北京泓信干细胞生物技术有限公司。

1.2 主要试剂 氯硝柳胺购自佛山信航生物科技有限公司（规格：50 mg/支），紫杉醇购自曼思特生物有限公司（规格：20 mg/支，批号：33069-62-4），PI3K/Akt通路抑制剂LY294002购自赛多利斯生物试剂公司（规格：20 mg/支），GAPDH一抗（规格：100 μl/支）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）一抗（规格：100 μl/支）购自美国Sigma公司。PI3K一抗（规格：200 μl/支）、磷酸化PI3K（phospho-phosphoinositide-3-kinase，p-PI3K）一抗（规格：100 μl/支）购自维润赛润生物试剂有限公司。磷酸化Akt（phospho-protein kinase B，p-Akt）一抗（规格：100 μl/支）、Akt一抗（规格：100 μl/支）购自美国 CST公司，P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）（规格：100 μl/支）购自博奥森生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 MDA-MB-231细胞株使用添加10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养，将细胞放在37℃和5%CO2的恒温恒湿培养箱中培养，培养至细胞80%融合后行Western blot法检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达水平。

1.3.2 细胞分组和细胞增殖能力检测 将耐药性MDA-MB-231细胞接种在96孔板中并分为3组，对照组使用紫杉醇（1 μmol/L）处理，氯硝柳胺组使用氯硝柳胺（3 μmol/L）处理，联合用药组使用氯硝柳胺（3 μmol/L）+LY294002（1 μmol/L）处理。各组细胞孵育12 h后按照试剂说明书使用MTT试剂进行染色，反应30 min后洗涤未结合的染料，并将染色的细胞溶解在10 mmol/L Tris（pH 10.0）中，在490 nm处检测吸光度以反映细胞增殖能力。

1.3.3 细胞凋亡情况检测 使用FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司）按照试剂盒说明书定量确定凋亡细胞的百分比：各组细胞不同处理24 h后，将1×107个细胞与FITC标记的膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）试剂在室温下于黑暗中染色15 min，洗涤后，在BDFACS Canto流式细胞仪（美国BD公司，型号：Attune NxT）上进行每个样品的采集，并使用BDFACS Diva软件分析收集的数据，并确定各组凋亡细胞的百分比（凋亡率）。

1.3.4 细胞迁移能力检测 将Transwell小室置于6孔板中，6孔板中加入2 ml细胞培养液，各组细胞处理24 h后将2×104个（200 μl）细胞加入小室内，37 ℃孵育48 h，PBS洗涤3次后在含有0.1%结晶紫和20%甲醇的染料溶液中染色30 min，使用倒置显微镜观察迁移细胞，随机挑选5个视野进行拍照和计数，迁移率=药物组迁移细胞数/对照组迁移细胞数×100%。

1.3.5 细胞PI3K/Akt通路相关蛋白表达水平检测 采用Western blot法。提取各组细胞总蛋白后，使用考马斯亮蓝法测量样品中的蛋白质浓度，用8%～15%SDS-PAGE（美国Millipore公司）分离等量的蛋白质（520 μg），并转移至聚偏二氟乙烯膜（美国Millipore公司），用5%BSA（美国Sigma-Aldrich公司）封闭膜，用抗 p-Akt、抗 Akt、抗 p-PI3K、抗 PI3K、抗裂解的 Caspase-3、抗P-gp或抗GAPDH室温孵育过夜，稀释度为1∶500，然后用增强的化学发光（ECL）检测试剂盒（英国GE Healthcare公司）检测蛋白印迹反映p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt表达水平。

1.3.6 小鼠异种移植肿瘤模型建立 30只4～6周龄的雄性SD小鼠购自温州医科大学动物实验中心，饲养于动物实验中心SPF级动实验室，自由饮食、饮水。将耐药性MDA-MB-231细胞（1×106个细胞）悬浮在100 μl无血清培养基中，并注射到小鼠左侧腹壁皮下，继续饲养2周；当肿瘤体积达到30 mm3时，将小鼠按随机数字表法分为3组，每组10只。对照组小鼠腹腔注射紫杉醇（10 mg/kg，溶于PBS），氯硝柳胺组小鼠腹腔注射氯硝柳胺（1.5 mg/kg，溶于PBS），联合用药组腹腔注射氯硝柳胺（1.5 mg/kg，溶于PBS）+LY294002（10 mg/kg，溶于 PBS），均 1次/d，共 35 d。然后每日用游标卡尺测量肿瘤大小，并计算肿瘤体积。5周后采用颈椎脱臼法处死小鼠，分离出肿瘤，称重后以10%甲醛溶液固定。

1.3.7 小鼠肿瘤组织Ki-67表达检测 采用免疫组化染色法。各组小鼠肿瘤组织固定48 h后使用石蜡包埋，切成2 μm切片后固定在载玻片上，与Ki-67抗体一起在含5%FBS的PBS中4℃孵育过夜。然后根据试剂盒说明书，在室温下用稀释的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）偶联物孵育切片，然后使用苏木精复染5 min，在显微镜下进行观察，使用图像分析软件Olympus cellSens Dimension计算表达阳性率。

1.4 统计学处理 采用GraphPad Prism 5.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组耐药性MDA-MB-231细胞增殖能力、迁移能力和凋亡情况比较 与对照组相比，氯硝柳胺组、联合用药组耐药性MDA-MB-231细胞增殖能力、迁移能力均明显下降，细胞凋亡明显增多，且联合用药组细胞增殖、迁移能力又较氯硝柳胺组明显下降，细胞凋亡明显增多，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图1、2、3。即氯硝柳胺抑制耐药性MDA-MB-231细胞的体外增殖和迁移，并诱导细胞凋亡。

图1 氯硝柳胺组、联合用药组、对照组耐药性MDA-MB-231细胞增殖能力比较

图2 氯硝柳胺组与对照组耐药性MDA-MB-231细胞迁移能力比较（a：迁移实验镜下所见比较，结晶紫染色，×400；b：细胞迁移能力比较，与对照组比较，*P＜0.05）

图3 氯硝柳胺组与对照组耐药性MDA-MB-231细胞凋亡情况比较（a：流式细胞图比较；b：细胞凋亡情况比较，与对照组比较，*P＜0.05）

2.2 3组耐药性MDA-MB-231细胞PI3K/Akt通路相关蛋白表达水平比较 与对照组相比，氯硝柳胺组、联合用药组耐药性MDA-MB-231细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达水平均下降，裂解的Caspase-3蛋白表达水平均上升，P-gp蛋白表达水平均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图4、5。即氯硝柳胺处理细胞后，细胞中PI3K/Akt通路的磷酸化水平被明显抑制，和LY294002联合用药可以进一步抑制PI3K/Akt通路的激活，并导致细胞中耐药标志物水平降低与细胞凋亡标志物水平上升。

图4 氯硝柳胺组、联合用药组、对照组耐药性MDA-MB-231细胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达水平比较（a：蛋白表达电泳图；b：蛋白磷酸化表达水平比较，与对照组比较，*P＜0.05）

图5 氯硝柳胺组、联合用药组、对照组耐药性MDA-MB-231细胞裂解的Caspase-3、P-gp蛋白表达水平比较（a：蛋白表达电泳图；b：蛋白磷酸化表达水平比较，与对照组比较，*P＜0.05）

2.3 3组小鼠移植肿瘤体积比较 5周后，与对照组比较，氯硝柳胺组、联合用药组小鼠移植肿瘤体积均缩小，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图6（插页）。

图6 氯硝柳胺组、联合用药组、对照组小鼠移植肿瘤体积比较（a：肿瘤生长曲线比较，与对照组比较，*P＜0.05；b：肿瘤肉眼所见比较）

2.4 3组小鼠移植肿瘤组织Ki-67表达情况比较 与对照组比较，氯硝柳胺组、联合用药组小鼠移植肿瘤组织Ki-67表达均下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图7。

图7 氯硝柳胺组、联合用药组、对照组小鼠移植肿瘤组织Ki-67表达情况比较（a：Ki-67表达情况镜下所见，×400；b：Ki-67表达阳性率比较，与对照组比较，*P＜0.05）

3 讨论

TNBC是常见的女性恶性肿瘤之一，我国乳腺癌的发病率不断上升，每年新发患者约36.9万例，其发病逐渐呈现年轻化趋势。由于TNBC的复发、转移等特性，以及获得性耐药、多重耐药性等问题，TNBC的临床治疗手段例如手术切除、化疗、放疗等效果欠佳[14]。因此，阐明其耐药机制并寻找有效的化疗药物具有重要的临床意义。本研究结果显示，在体外细胞培养和体内动物模型中，氯硝柳胺均具有良好的抗肿瘤活性，可以有效的抑制耐药性TNBC的体内外进展。耐药性乳腺癌具有高度耐药以及向身体其他器官转移的潜力，是引起女性癌症死亡的重要因素[15]。研究表明，乳腺癌的侵袭性和高度转移性特征与PI3K/Akt转导通路的异常激活有关[16]。氯硝柳胺也称灭绦灵、贝螺杀，是一种水杨酰胺类衍生物，其作用机制为抑制虫体细胞内线粒体氧化磷酸化过程，能量物质ATP生成减少。近年来的研究表明氯硝柳胺具有广泛的药理活性，包括抗癌、抗菌及抗纤维化等作用[17-18]，可通过激活Caspase-8/t-Bid线粒体途径诱导乳腺癌细胞的凋亡，发挥抗乳腺癌作用，并通过JAK/STAT3信号通路的调节而诱导癌细胞自噬，发挥化疗增敏作用。本研究使用氯硝柳胺对耐药性MDA-MB-231细胞进行处理，结果显示，耐药性MDA-MB-231细胞中PI3K/Akt信号转导被明显抑制，耐药蛋白表达降低，细胞增殖与侵袭能力被显著抑制，且细胞凋亡明显增加，并表现为凋亡相关蛋白的明显上调。PI3K/Akt通路广泛参与各种细胞过程，例如细胞增殖、细胞分化以及细胞凋亡，在血管生成和转移过程中起着至关重要的作用，与乳腺癌的发展、侵袭以及化疗耐药密切相关[19]。而在联合使用PI3K抑制剂之后，氯硝柳胺诱导的信号通路抑制和抗癌活性被进一步增加，提示氯硝柳胺可以部分地通过PI3K/Akt信号抑制而发挥抗癌活性，体内实验则进一步证实，氯硝柳胺可通过PI3K/Akt信号抑制耐药性肿瘤的体内进展。

总之，本研究结果表明，氯硝柳胺通过PI3K/Akt信号转导而抑制耐药性TNBC细胞的侵袭和增殖，并诱导细胞凋亡，进而抑制肿瘤的体内进展。