GRIN2A、GRIN2B基因多态性与哌甲酯治疗注意缺陷多动障碍疗效的关系研究

丁凯景 丁雨钦 刘艳 简凤清 孙宁 王少华 周国岭

注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder,ADHD）是一种常见的神经发育障碍，患者主要表现为注意力不集中、多动和（或）冲动[1]，其患病率几乎没有地域或跨文化差异，并常共病对立违抗障碍、品行障碍[2]，还可能共病特定学习障碍、破坏性心境失调、间歇性暴怒障碍、焦虑障碍、重性抑郁障碍等疾病[1]，全球儿童青少年患病率约为5.29%，成人患病率约为4.4%[3]。ADHD对患者的教育、生活、工作等多项个人发展问题影响深远，造成家庭、社会的巨大负担，是一项重要的公共卫生课题。遗传基因在ADHD和共患疾病的病因学中起到至关重要的作用。既往家系、寄养子、双生子研究表明，ADHD有家族聚集性，其遗传度大约为74%，因此，遗传因素是ADHD的发病机制之一[4]。然而，目前对与ADHD直接相关的特异性基因以及具体遗传模式的研究较少。本研究选取谷氨酸能系统候选基因N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR）亚基NMDA2A基因（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2A，GRIN2A）和NMDA2B基因（glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 2B,GRIN2B）的2个单核苷酸多态位点（single nucleotide polymorphisms,SNPs）进行研究，探讨候选基因多态性与ADHD兴奋剂哌甲酯药物治疗疗效的关系，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 纳入2016年2月至2019年2月在杭州市第七人民医院儿童心理科门诊就诊及住院的6～15岁且符合《美国精神疾病诊断统计手册第五版》（The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders Fifth Edition，DSM-5）诊断标准的ADHD患儿80例。排除标准：（1）中国修订韦氏儿童智力测验（Chinese Wechsler intelligence scale for children,C-WISC）＜70分；（2）目前或既往符合精神分裂症、自闭症谱系障碍、情绪障碍、抽动秽语综合征、癫痫及其他器质性精神疾病者。剔除因严重药物不良反应脱落的4例（反复呕吐2例、严重失眠1例、易激惹1例），失联2例，最终纳入74例，其中男57例，女17例，中位年龄10（8，11）岁。本研究经杭州市第七人民医院医学伦理委员会批准，所有患者法定监护人均签署知情同意书。

1.2 方法 使用自制临床信息调查表进行基本资料的收集。由2位主治及以上的儿童精神科医师以DSM-5诊断标准确诊ADHD[1]。采用SNAP-Ⅳ儿童注意力量表评估ADHD患儿的严重程度并进行亚型分类[5]，采用C-WISC、Conners父母评症状量表（Conners parent symptom questionnaire,PSQ）、注意力竞量测验（the test of variables of attention,T.O.V.A.）等评估工具，对患儿进行认知、行为、注意力的系统测评。

其中，SNAP-Ⅳ有26项条目，包含注意缺陷分量表（第1～9题）、多动冲动分量表（第10～18题）、对立违抗分量表（第19～26题），由患儿父母填写。PSQ量表有48项条目，包含冲动多动、品行问题、多动指数、学习问题、心身障碍和焦虑6个因子，由患儿父母填写。T.O.V.A.是一种持续性操作测验，包含理解力商数、控制力商数、注意力商数、多动商数值等指标。

在药物治疗前、治疗8周后进行疗效及不良反应评估，并记录上述神经心理测验及量表评分。根据既往文献，设定哌甲酯治疗8周后SNAP-Ⅳ的注意缺陷与多动冲动分量表共18项条目减分率≥30%者为治疗有效者，对立违抗分量表8项条目减分率≥30%者为对立违抗改善者[6]。

1.3 基因检测 所有入组患儿在治疗前均抽取外周静脉血3 ml，置于EDTA抗凝管-20℃冰箱保存，抽提样本DNA[血液基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司]，采用紫外分光光度法进行DNA浓纯度测定，保存于-80℃冰箱备用。根据美国国立生物信息情报中心检索dbSNP数据库（Datebase of Single Nuleotide Polymorphisms,dbSNP）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）以及既往文献[7-8]，选取GRIN2A rs2229193和GRIN2B rs2284411作为候选基因位点，以及设计扩增引物（GRIN2B基因：5'-ACGTTGGATGATGACATCATCAGT GTCTGC-3'and 5'-ACGTTGGATGCATGACTTTTTTCC CCTACTC-3'，GRIN2A 基因：5'-ACGTTGGATGTTGAC GAACTTCCGACATGG-3'and 5'-ACGTTGGATGCGTCATCGTGGAAGACATAG-3'）。使用SNP基因分型试剂盒（40×TaqMan®SNP Genotyping Assay Mix，美国ABI公司）及万能PCR液[Premix Ex TaqTM，宝生物工程（大连）有限公司]，在ABI 7300实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）上进行实验操作，PCR循环参数：95℃ 30 s预变性，95℃ 5 s、60℃ 34 s，40个循环。扩增反应完成后，读取反应后的荧光数据，利用内置软件进行等位基因分型。采用PCR凝胶电泳检测扩增产物，并随机选取两个样本测序验证多态性与实验室数据一致性。

1.4 统计学处理 采用Haploview软件进行候选基因多态位点Hardy-Weinberg遗传平衡检验和连锁不平衡分析。采用SPSS 24.0统计软件。非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用独立样本非参数秩和检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 经Hardy-Weinberg遗传平衡检验，候选基因SNPs基因型频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律（P＞0.05）。样本有群体代表性，基因频率能代表群体的基因分布。

2.2 不同基因型ADHD患儿治疗前症状的比较GRIN2A基因G/G基因型60例，G/A基因型14例，无A/A基因型。GRIN2B基因C/C基因型55例，T/C基因型18例，T/T基因型1例。

GRIN2A基因G/A+A/A基因型患儿的SNAP-Ⅳ对立违抗分量表得分、PSQ品行问题项目得分均较G/G基因型患儿高（均P＜0.01），两种基因型患儿在SNAP-Ⅳ其他分量表得分、C-WISC得分、PSQ其他项目得分、T.O.V.A.得分比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。GRIN2B基因T/C+T/T基因型患儿的SNAP-Ⅳ注意缺陷分量表得分较C/C基因型患儿更高（P＜0.05），而在SNAP-Ⅳ其他分量表得分、C-WISC、PSQ、T.O.V.A.得分比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 不同基因型ADHD患儿治疗前症状的比较（分）

2.3 不同疗效患儿基因型频率的比较 74例患儿中治疗有效49例，治疗无效25例。治疗有效和治疗无效患儿间GRIN2A基因G/A+A/A基因型频率与G/G基因型频率、GRIN2B基因T/C+T/T基因型频率与C/C基因型频率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 不同疗效患儿基因型频率的比较[例（%）]

74例患儿中对立违抗改善49例，对立违抗未改善25例。对立违抗改善与未改善患儿的GRIN2A基因G/A+A/A基因型频率与G/G基因型频率比较差异有统计学意义（P＜0.05），而GRIN2B基因T/C+T/T基因型频率和C/C基因型频率比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 不同对立违抗疗效患儿基因型频率的比较[例（%）]

3 讨论

既往ADHD的遗传易感性和药物基因组研究多集中于多巴胺能、去甲肾上腺素能系统，但越来越多的研究开始关注谷氨酸能的作用。对ADHD患儿和成人患者的影像学研究显示，其大脑前额叶和纹状体中的谷氨酸盐/谷氨酰胺水平升高[9]；哌甲酯治疗会改变幼年大鼠前额叶皮层的NMDAR组成和突触可塑性[10]，选择性激活或抑制NMDAR介导的突触后电流，调节认知增强作用或精神症状诱导。因此，前额叶中功能失调的谷氨酸系统可能是ADHD表型的关键因素；谷氨酸受体基因可能在儿童多动症治疗响应药物疗效过程中发挥重要作用。

谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中含量最丰富的一种氨基酸类兴奋性神经递质，参与神经系统多种重要功能的调节[11]。谷氨酸在ADHD发病机制中扮演了重要的角色。既往研究显示，ADHD患儿大脑前扣带皮层中谷氨酸代谢显著增加[12]。ADHD大鼠模型也发现了前额叶纹状体中谷氨酸代谢水平的紊乱[13]。NMDAR不仅能帮助调节神经元的存活，调节神经元的树突、轴突结构发育及参与突触可塑性的形成，并且对神经元回路的形成亦起着关键的作用，在学习和记忆过程中也是一类至关重要的受体[14]。

盐酸哌甲酯是治疗ADHD的经典药物之一，一般认为它是通过阻断突触前神经元的去甲肾上腺素和多巴胺再摄取，以及增加这些单胺类神经递质释放到突触间隙，实现对ADHD的治疗作用，但具体机制尚不明确。哌甲酯治疗会改变幼年大鼠前额叶皮层的NMDAR组成和突触可塑性[10]，选择性激活或抑制NM-DAR介导的突触后电流调节认知增强作用或精神症状诱导。因此，前额叶中功能失调的谷氨酸系统可能是ADHD表型的关键因素。谷氨酸受体基因可能在儿童多动症治疗响应哌甲酯疗效中发挥作用[15-16]。

全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）研究显示，离子型谷氨酸受体变异与多动症有关。谷氨酸离子型受体红藻氨酸型亚基4（glutamate ionotropic receptor kainate type subunit 4,GRIK4）基因rs655824位点的变异、谷氨酸离子型受体delta型亚基 2（glutamate ionotropic receptor delta type subunit 2,GRID2）基因突变在多动症的易感性中起着潜在作用[17-18]。基因组测序分析表明，谷氨酸盐基因组与多动/冲动症状的严重程度相关[19]。同时具有GRIN2B基因rs2268119 A/T或T/T基因型和低社会经济地位的儿童注意力问题更多[20]。GRIN2B基因rs2284411与ADHD的注意力缺陷、冲动多动症状均有关联[21]。GRIN2A基因5号外显子的遗传变异与ADHD的发病风险增加相关[22]。ADHD患者GRIN2B等位基因与持续操作性测验（continuous performance test,CPT）的持续性正确反应时间存在关联，C/C亚组的持续性正确反应时间高于C/T+T/T亚组；GRIN2A等位基因的G/G亚组比G/A+A/A亚组在CPT测验中存在更多的遗漏错误[8]。在一项对187例ADHD儿童的GWAS研究中，发现谷氨酸代谢型受体7（glutamate metabotropic receptor 7,GRM7）基因可能与哌甲酯反应有关[23]。经过8周的哌甲酯治疗，GRM7基因rs37952452 G/A基因型的ADHD儿童比G/G基因型携带者的临床改善效果更好[15]。GRIN2B基因rs2284411位点C/C基因型显示出对哌甲酯更好的治疗反应，GRIN2B基因C/C基因型在CPT响应时间变异性上也显示出更明显改善，GRIN2A基因G/G基因型比G/A基因型则显示出更明显的CPT错分误差改善[7]。GRIN2B基因与左侧上顶叶簇的静态区域同质性均值（ReHo）有显著的诊断和交互作用[24]。然而，在所有相关的GWAS研究中，没有一个谷氨酸受体基因达到全基因组显著水平。Adams等[11]研究并未发现GRIN2A基因与ADHD冲动控制、认知表型的显著关联；Nyman等[25]研究也并未发现GRIN2A多态性与ADHD的阳性结果；高雪屏等[26]研究应用基因扫描技术，探索验证了GRIN2A的G1430A位点多态性与ADHD可能并无关联。

本研究验证了ADHD患儿中GRIN2A基因A等位基因携带组有更多的对立违抗行为和品行问题，提示GRIN2A基因多态性可能与ADHD共病对立违抗障碍及品行障碍相关，同时发现ADHD患者GRIN2B基因T等位基因携带组表现出更显著的注意缺陷症状。与既往相关研究得到不一致性的结果可能与种族差异、有限的样本量和统计分析方法的差异导致的。在大多数情况下，多动症是由几种遗传和环境风险因素引起的，每种因素都有很小的个体效应，并共同增加了ADHD易感性。

综上所述，GRIN2A、GRIN2B基因候选位点SNP在哌甲酯治疗ADHD的药物影响无明显作用，但在对立违抗行为的组间比较中发现，GRIN2A基因的G/A+A/A基因型较G/G基因型有更高的SNAP-Ⅳ对立违抗分量表减分率，提示GRIN2A基因中A等位基因携带组在接受哌甲酯治疗后，对立违抗行为显著减少，提示GRIN2A基因多态性可能与哌甲酯改善ADHD患者对立违抗行为的疗效相关。