miR-16-5p通过调控PD-L1表达影响肝星状细胞炎症反应的研究

詹东昂 柯峰 杨超 刘华

肝纤维化是对一系列慢性肝损伤的愈合反应，主要特征为细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积并最后发展为肝硬化[1]。肝星状细胞被激活后增殖，大量分泌ECM导致肝纤维化发生[2]。miRNA为小分子非编码RNA，长度约21～25个碱基，广泛参与调控细胞的增殖、凋亡及机体炎症反应等多种生命活动[3-5]。相关研究报道miRNA参与调节肝纤维化的发生，如马艳华等[6]研究表明健康人与肝纤维化患者的血浆样本中存在104个差异miRNA，其中72个表达下调，包括miR-450b-5p、miR-455-5p等，32个miRNA表达上调，包括miR-16-5p、miR-182-5p等；冉龙娇等[7]也发现在肝星状细胞的活化及肝纤维化过程中，均有多种miRNA出现差异表达，或上调或下调。通过靶基因预测在线分析发现，miR-16-5p可能与程序性死亡受体-1（programmed cell death-1,PD-1）存在结合位点，PD-1及其配体PD-L1（CD274）属于负共刺激分子，主要参与调控多种肿瘤及自身免疫性疾病的免疫逃逸过程，抑制免疫应答的激活，目前作为肿瘤等治疗的重要免疫检查点[8]。相关研究表明，抑制PD-1/PD-L1表达与治疗自身免疫性肝炎密切相关[9]。因此推测miR-16-5p可能介导PD-L1表达参与调控活化的肝星状细胞及炎症反应。本实验以大鼠肝星状细胞HSC-T6为研究对象，探讨miR-16-5p是否参与调控PD-L1表达而影响肝星状细胞生理形态及炎症水平，以期为临床上治疗肝纤维化及炎症提供可能的治疗靶点，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料 肝星状细胞HSC-T6（武汉普诺赛生命科技有限公司）；DMEM培养基（美国Hyclone公司，批号：SH30022.01B）；FBS（美国 Gibco公司，批号：10270-106）；PBS（批号：P1010）、胰蛋白酶（批号：T1350）和浓度测定试剂盒（批号：PC0020）均来自北京索莱宝科技有限公司；Trizol试剂（美国Ambion公司，批 号 ：15596026）；转 化 生 长 因 子 β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1，英国Abcam公司）；CCK-8试剂盒（中国Solarbio公司，批号：CA1210）；蛋白质Marker（美国Helix公司，批号：P12103）；PVDF转移膜和化学发光试剂（中国Millipore公司，批号：IPVH00010）；鼠抗细胞PD-L1抗体、兔抗NF-κB抗体、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗体 、羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG（中国Bioswamp公司）；兔抗磷酸化的NF-κB（nuclear factor kappa B,p-NF-κB）抗体（中国CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组及处理 HSC-T6细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2培养箱内培养，均按照1∶2～1∶4进行传代。将细胞分为6组并分别处理：对照组、模型组（5 ng/ml TGF-β1处理48 h）、miR-16-5p超表达组（转染miR-16-5p mimics 24 h后，再用 5 ng/ml TGF-β1处理48 h）、miR-16-5p抑制组（转染miR-16-5p inhibitor 24 h后，再用5 ng/ml TGF-β1处理48 h）、超表达-空载组（转染mimics-NC 24 h后，再用5 ng/ml TGF-β1处理48 h）和抑制-空载组（转染inhibitor-NC 24 h后，再用5 ng/ml TGF-β1处理48 h）。

1.2.2 细胞转染 将 100 pmol miRNA、5 μl Lipofectamine 2000分别稀释于250 μl Opti-MEM中，混匀后，将两者混合液室温孵育20 min，然后将其加入到融合度为90%的细胞中，37℃、5%CO2转染4 h后，更换新鲜培养基，培养24 h，测定miR-16-5p的表达水平以观察转染效果。

1.2.3 各组细胞 TNF-α、IFN-γ、miR-16-5p、PD-L1、IL-6、IL-10 mRNA表达水平检测 采用RT-qPCR法。加入TGF-β1处理48 h收集细胞，用Trizol法提取各组细胞总RNA，将mRNA反转录成cDNA。以cDNA为模板进行qPCR扩增。反应条件为：95℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共40个循环，其中GAPDH和U6作为内参进行样品间的校正，使用2-ΔΔCt法进行统计分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.4 各组细胞形态学观察 收集各组细胞，稀释细胞悬液浓度至1×105个细胞/孔，每孔2 ml，37℃、5%CO2培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。对照组于正常培养基中培养，模型组、miR-16-5p超表达组、miR-16-5p抑制组、超表达-空载组和抑制-空载组的细胞培养基中加入终浓度为5 ng/ml的TGF-β1，继续培养24、48、72或48 h。取出细胞培养板，光镜下观察各组细胞形态，拍照、收样。

1.2.5 各组细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。将细胞浓度稀释为3×103个细胞/孔，取100 μl细胞液接种到96孔板，37℃、5%CO2培养箱中培养过夜，使细胞贴壁。对照组于正常培养基中培养，另外5组细胞培养基中加入终浓度为5 ng/ml的TGF-β1刺激48 h，然后均加入10 μl CCK-8溶液，继续培养4 h。酶联免疫检测仪测量各孔450 nm处的吸光值，以吸光值表示细胞增殖能力。同时设置调零孔（培养基、CCK-8溶液），每组设定3个复孔。

1.2.6 各组细胞PD-L1、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达水平检测 采用Western blot法。收集各组细胞，加入适量预冷的1×PBS洗涤后，按照每1×106个细胞加入裂解液200 μl，充分裂解后，取上清液进行蛋白质定量。SDS-PAGE电泳后，选用90 V转膜50 min，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，加一抗，PD-L1抗体（1∶2 000）、NF-κB抗体（1∶1 000）、p-NF-κB抗体（1∶1 000）和GAPDH抗体（1∶10 000）室温孵育1 h，洗膜，按照1∶10 000稀释HRP标记的二抗，室温孵育1 h。洗膜，选用ECL化学发光法显色，通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组和模型组细胞形态学比较 光镜下观察可见，对照组和模型组细胞在开始培养时（0 h），细胞形态和数量无明显差异。与对照组同期培养时间相比（24、48、72 h），模型组细胞数量明显增多，延展性更好，并且5 ng/ml TGF-β1刺激后，细胞表现为肌纤维细胞形态的特征。随着培养时间增加，细胞密度增大，形态变小，呈现出多边形的梭形，且相邻细胞有伪足相连，在培养板表面整齐均匀分布。见图1。

图1 对照组和模型组细胞形态学比较（a、b、c、d：分别为对照组细胞培养0、24、48、72 h；e、f、g、h：分别为模型组细胞培养0、24、48、72 h；×200）

2.2 TGF-β1不同作用时间的模型组细胞TNF-α、IFN-γ mRNA表达水平比较 与TGF-β1作用0 h相比，TGF-β1作用24 h时的模型组细胞TNF-α、IFN-γ mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；TGF-β1作用48、72 h时的模型组细胞TNF-α、IFN-γ mRNA表达水平比较显著增高（均P＜0.05），且以48 h时最高（P＜0.05）。见图2。

图2 TGF-β1不同作用时间的模型组细胞TNF-α、IFN-γ mRNA表达水平比较

2.3 各转染组细胞转染效果比较 与对照组相比，超表达-空载组和抑制-空载组细胞中miR-16-5p表达水平差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与超表达-空载组相比，miR-16-5p超表达组细胞miR-16-5p表达水平升高（P＜0.05）；与抑制-空载组相比，miR-16-5p抑制组细胞miR-16-5p表达水平降低（P＜0.05）。见图3。

图3 各转染组细胞miR-16-5p表达水平比较

2.4 模型组、miR-16-5p超表达组、miR-16-5p抑制组、超表达-空载组和抑制-空载组细胞形态学比较与模型组相比，miR-16-5p超表达组细胞数量明显减少，肌纤维细胞形态减少；miR-16-5p抑制组细胞数量明显增多，形态无明显变化；超表达-空载组和抑制-空载组细胞形态及数量无明显差异。见图4。

图4 模型组、miR-16-5p超表达组、miR-16-5p抑制组、超表达-空载组和抑制-空载组细胞形态学比较（a：模型组；b：miR-16-5p超表达组；c：miR-16-5p抑制组；d：超表达-空载组；e：抑制-空载组；×200）

2.5 各组细胞增殖能力比较 与模型组相比，miR-16-5p-超表达组A值明显降低（P＜0.05），细胞增殖能力下降；miR-16-5p抑制组A值明显升高，细胞增殖能力增强（P＜0.05）；超表达-空载组和抑制-空载组细胞增殖能力均无明显变化（均P＞0.05）。见图5。

图5 各组细胞增殖能力比较

2.6 各组细胞PD-L1、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达水平比较 与模型组相比，超表达-空载组和抑制-空载组细胞中PD-L1、p-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平均无统计学差异（均P＞0.05）；miR-16-5p超表达组PD-L1蛋白表达水平升高（P＜0.05），p-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平降低（P＜0.05）；miR-16-5p抑制组PD-L1蛋白表达水平降低（P＜0.05），p-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平均升高（均P＜0.05）。见图6。

图6 各组细胞PD-L1、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达水平比较（a：蛋白表达电泳图比较；b：PD-L1蛋白表达水平比较；c：p-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平比较）

2.7 各组细胞miR-16-5p、PD-L1、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 mRNA表达水平比较 与模型组相比，超表达-空载组和抑制-空载组细胞miR-16-5p、PD-L1、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 mRNA 表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；miR-16-5p超表达组miR-16-5p、PD-L1、IL-10 mRNA表达水平均升高（均 P＞0.05），TNF-α、IFN-γ、IL-6 mRNA 表达水平均降低（均P＞0.05）；miR-16-5p抑制组miR-16-5p、PD-L1、IL-10表达水平均降低（均P＜0.05），TNF-α、IFN-γ、IL-6 mRNA表达水平均升高（均P＜0.05）。见图7。

图7 各组细胞miR-16-5p、PD-L1、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 mRNA表达水平比较

3 讨论

肝星状细胞分为静息和激活两种状态，在某些介质因素如活性氧物质、纤维化细胞因子如TGF-β、血小板源生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）[10]等的刺激下，肝星状细胞被激活，增殖并转化为肌成纤维细胞样细胞（myofibroblast like cells,MFB）[2]。肝星状细胞的活化属于级联活化模式，肝细胞受损后分泌有丝分裂的作用因子刺激自身细胞增殖，丧失接触抑制能力，同时与其毗邻细胞共同作用释放大量TNF-α、TNF-β、IFN-γ等细胞因子促进肝星状细胞活化、增殖，另外MFB样细胞也会自分泌TGF、PDGF等细胞因子促进自身的活化及增殖等[11]。本研究选用TGF-β1刺激HSC-T6细胞0、24、48、72 h，TGF-β1介导的TGF-β/Smad信号通路是肝星状细胞活化及增生的关键环节[10]，结果显示细胞增殖具有时间诱导依赖性，细胞数量随药物处理时间的延长而增多，另外发现TGF-β1刺激HSC-T6细胞48 h，细胞内TNF-α和IFN-γ表达含量显著升高，这表明TGF-β1处理48 h时，细胞内的炎症反应最强，HSC活化正处于最繁盛时期。因此筛选此时间点为TGF-β1的最佳作用时间。

我国有大量的急性肝炎发展为慢性炎症，最终形成肝硬化的病例。肝纤维化的发展速度受发病病因、环境和遗传因素等的影响[12]。近年来大量文献表明多种miRNA与肝纤维化的发生密切相关，miRNA的异常表达参与调控HSC的活化及肝纤维化相关信号通路[13]。如Lakner等[14]通过miRNA微阵列分析静息态HSC被激活后miRNA的表达情况，发现3种miRNA表达上调（miR-34c、miR-184和miR-221），8种miRNA表达下调（miR-16、miR-19a、miR-19b、miR-29a、miR-29c、miR-92a、miR150、miR-194）。本研究发现肝星状细胞被TGF-β1刺激活化后，胞内miR-16-5p的表达水平也出现下调，并且预测的目的靶蛋白PD-1表达水平也明显下降，与miR-16-5p的表达呈正相关。PD-1是一种免疫共抑制分子，通过负调控T、B细胞激活而抑制免疫应答，张宏宇等[15]研究表明PD-1通过抑制其表达降低肝细胞损伤，减少炎症反应，抑制肝炎向肝纤维化的发展。本研究检测肝星状细胞活化后相关炎症细胞因子，发现促炎症因子p-NF-κB/NF-κB、TNF-α、IFN-γ、IL-6表达水平显著升高，而抗炎因子IL-10表达水平明显降低。NF-κB可调控多种炎症和抗炎因子的表达来调节肝星状细胞的活化、增殖从而影响肝纤维化的发展[16-17]；IFN-γ和TNF-α在人表皮淋巴管内皮细胞的炎症反应中具有协同促进PD-L1表达的作用[11]。与之相同，对比模型组，miR-16-5p超表达组细胞内miR-16-5p、PD-L1表达上调，炎症反应降低，抑制细胞增殖；miR-16-5p抑制组miR-16-5p、PD-L1表达下调，细胞活化增殖，炎症反应加剧。

综上所述，miR-16-5p在激活的肝星状细胞中的表达水平低于静息态细胞，高表达miR-16-5p可促进PD-L1表达上调，抑制细胞增殖，降低细胞炎症反应，其作用机制可能参与治疗肝纤维化的发展。