p63、Ki-67在乳腺浸润性导管癌中的表达及与新辅助化疗的关系

张牛牛 魏巴金 李成志 傅佩芬 代志军

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。数据表明，乳腺癌在全球女性恶性肿瘤中占比24.2%，居女性恶性肿瘤的首位，而且发病率有逐年上升趋势，对女性的身心健康造成了严重的影响[1-2]。乳腺癌新辅助化疗是指患者在接受外科手术前行化疗的方法，常应用于局部晚期或有降级保乳意愿的患者。术前对乳腺癌患者行新辅助化疗，可以缩小肿瘤体积降低分期，从而增加手术切缘阴性以及获得病理完全缓解（pathological complete remission,pCR）的可能性。有研究表明，在新辅助化疗后获得pCR的患者可能比没有获得pCR的患者存活更长的时间[3]。然而，临床发现新辅助化疗仍对很大一部分乳腺癌患者无效。因此，探索预测乳腺癌患者对新辅助化疗有无反应并能否受益于新辅助化疗的生物标志物有重要意义。雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）与新辅助化疗之间的关系已有较多的研究。p63是p53的家族成员，在诱导细胞周期停滞、细胞衰老、细胞凋亡及细胞分化中发挥重要作用。p63阳性表达的乳腺癌患者术后pCR率高于p63阴性表达者[4]。Ki-67是一种与细胞周期密切相关的核蛋白，代表着肿瘤的增殖程度（以增殖指数表示），增殖指数越高，乳腺癌患者的预后越差[5]。因此，p63与Ki-67与乳腺癌的预后相关[6]。本研究通过分析p63与Ki-67在乳腺癌患者新辅助化疗前后的表达变化，探讨其与患者新辅助化疗疗效的关系，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2015年1月至2021年6月在浙江大学医学院附属第一医院住院治疗的乳腺癌患者202例。纳入标准：（1）临床病理资料完整；（2）女性患者；（3）化疗前均经病理穿刺活检确诊浸润性导管癌，且无远处转移；（4）符合新辅助化疗适应证，且无化疗禁忌证。排除标准：（1）双侧乳腺癌；（2）妊娠期乳腺癌；（3）炎性乳腺癌；（4）有乳腺癌病史者；（5）曾经接受过放疗、化疗、靶向治疗以及内分泌治疗者。患者年龄30～76岁，中位年龄50岁；≤50岁110例，＞50岁92例；绝经前105例，绝经后97例；化疗前肿瘤直径＞5 cm 22例，≤5 cm 180例；区域淋巴结无转移40例，有转移162例；分子分型Luminal A型16例，Luminal B型47例，人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2,Her-2）阳性、激素受体（hormone receptor,HR）阳性50例，Her-2阳性、HR阴性38例，Basal-like型51例。

1.2 治疗方法 患者根据不同的分子分型及淋巴结转移等情况，采取合适的新辅助化疗方案。主要化疗方案为EC-T（表柔比星90 mg/m2+环磷酰胺600 mg/m2，序贯多西他赛100 mg/m2，21 d）和AC-T（多柔比星脂质体35 mg/m2+环磷酰胺600 mg/m2，序贯多西他赛100 mg/m2，21 d）。Her-2阳性的患者同时进行H（曲妥珠单抗，首剂8 mg/kg，之后6 mg/kg，21 d）、P（帕妥珠单抗，首剂840 mg，之后420 mg，21 d）共计1年的靶向治疗。新辅助化疗期间患者定期复查乳腺B超、肝胆脾胰B超、肺部CT、肿瘤标志物等指标，以了解肿瘤的缓解情况。所有患者完成新辅助化疗，并在新辅助化疗期间或新辅助化疗结束后行乳腺癌保乳根治术或乳腺癌改良根治术。

1.3 新辅助化疗前后乳腺癌组织p63、Ki-67表达情况检测 采用免疫组化法。分别将患者化疗前穿刺活检或术后从手术切除标本中所取的乳腺癌组织常规制备石蜡组织切片，厚度为4 μm，经脱蜡、水化，常规进行免疫组化染色。p63、Ki-67检测试剂均为鼠抗人单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），操作步骤严格按照说明书进行。p63、Ki-67染色阳性细胞为细胞核内出现棕黄色颗粒。p63表达情况按照癌细胞阳性百分率评判：无阳性细胞为阴性，阳性细胞＜25%为+，25%～50%为++，＞50%为+++，+～+++为阳性。Ki-67表达情况也按照癌细胞阳性百分率评判：阳性细胞＜15%为低表达，≥15%为高表达。

1.4 pCR评判标准 根据《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2021年版）》，术后病理检查乳腺癌原发灶无浸润性癌（可存在导管原位癌）且区域淋巴结阴性视为pCR。

1.5 观察指标 （1）分析新辅助化疗前患者乳腺癌组织p63、Ki-67表达情况与临床病理特征、术后pCR的关系；（2）比较新辅助化疗前后患者乳腺癌组织p63、Ki-67表达情况；（3）分析新辅助化疗前后患者乳腺癌组织p63表达变化与pCR、区域淋巴结转移的关系。

1.6 统计学处理 采用SPSS 24.0统计软件。计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新辅助化疗前患者乳腺癌组织p63、Ki-67表达情况与临床病理特征的关系分析 新辅助化疗前患者乳腺癌组织p63表达情况与淋巴结转移有关（P＜0.05），与年龄、月经状态、肿瘤大小、分子分型均无关（均P＞0.05）；Ki-67表达情况与分子分型有关（P＜0.05），与年龄、月经状态、肿瘤大小、淋巴结转移均无关（均P＞0.05）。见表1。

表1 新辅助化疗前患者乳腺癌组织p63、Ki-67表达情况与临床病理特征的关系分析[例（%）]

2.2 新辅助化疗前患者乳腺癌组织p63、Ki-67表达情况与pCR的关系 新辅助化疗前，乳腺癌组织p63表达阳性和表达阴性患者pCR率分别为53.8%（14/26）和32.4%（57/176），p63表达阳性患者高于表达阴性患者（P＜0.05）；Ki-67高表达和低表达患者pCR率分别为36.9%（69/187）和13.3%（2/15），差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 新辅助化疗后患者乳腺癌组织p63表达情况 对化疗后仍然在病理报告上存在p63检测结果的114例患者（202例患者中41例患者获得pCR，4例患者病理Miller-Payne 5级而未进行p63检测）进行分析，结果显示患者乳腺癌组织p63表达阳性率由化疗前的11.4%（13/114）上升到化疗后的40.4%（46/114）。

2.4 新辅助化疗后患者乳腺癌组织Ki-67表达情况对化疗后仍然在病理报告上存在Ki-67检测结果的134例患者（202例患者中54例患者获得pCR，4例患者病理Miller-Payne 5级而未进行Ki-67检测）进行分析，结果显示患者乳腺癌组织Ki-67低表达率由化疗前的9.0%（12/134）上升到化疗后的46.3%（62/134）。

2.5 新辅助化疗后患者乳腺癌组织p63表达变化与pCR的关系 新辅助化疗后乳腺癌组织p63表达阴性转阳性的患者术后pCR率＞p63表达阳性不变的患者＞p63表达阴性不变的患者＞p63表达阳性转阴性的患者（均P＜0.05）。见表2。

表2 新辅助化疗后患者乳腺癌组织p63表达变化与pCR的关系[例（%）]

2.6 新辅助化疗后患者乳腺癌组织p63表达变化与区域淋巴结转移的关系 从新辅助化疗后病理报告上存在p63检测结果的114例患者中，选出新辅助化疗前区域淋巴结有转移的患者91例进行统计分析。结果显示新辅助化疗后乳腺癌组织p63表达阴性转阳性的患者区域淋巴结阳性转阴性率＞p63表达阳性不变患者＞p63表达阴性不变患者＞p63表达阳性转阴性患者（均P＜0.05）。见表3。

表3 新辅助化疗后患者乳腺癌组织p63表达变化与区域淋巴结转移的关系[例（%）]

3 讨论

新辅助化疗能够使乳腺癌患者的肿瘤缩小，降低分期，利于手术，使患者可以行保乳手术。同时，新辅助化疗有助于了解肿瘤对化疗药物的敏感性，为进一步化疗提供有价值的疗效预测依据，避免可能的无效化疗。在乳腺癌新辅助化疗中，取得pCR的患者比未取得pCR的患者能够获得更好的预后。

Ki-67是一种核蛋白，与细胞的增殖有关，在细胞周期的S期、G1期、G2期和M期均有表达，但是在不同的周期中表达并不同，在M期达到峰值[7]。在乳腺癌患者中，Ki-67高表达与较差的生存率及预后相关[8]。因此，可以通过新辅助化疗前后Ki-67表达的变化来评估新辅助化疗的效果。本研究结果显示，新辅助化疗后，乳腺癌组织Ki-67低表达率明显升高，由化疗前的9.0%上升到化疗后的46.3%。这表明新辅助化疗可以明显降低Ki-67高表达乳腺癌患者的增殖指数。新辅助化疗对增殖活跃的肿瘤细胞有显著的杀伤作用。同时，在新辅助化疗前Ki-67高表达患者术后pCR率为36.9%，高于低表达患者的13.3%。这表明Ki-67高表达的乳腺癌患者对新辅助化疗更为敏感。

p63基因位于染色体3q27-29上，由15个外显子组成，大小约220 kB，内含子长度达100 kB[9]，是p53的家族成员。其基因产物对于维持几种上皮组织中的干细胞群至关重要，并且对于包括乳腺在内的上皮器官的正常发育是必需的[10]。在乳腺形态发育的早期阶段，患者的乳腺可能暴露于某些外部或内部损伤中，这些损伤可能对某些原始干细胞的DNA结构造成永久性损伤。这些DNA结构损伤导致了更新肌上皮细胞的相关基因失活或缺陷，损伤了肌上皮细胞的补充过程，以至于无法取代老化或损伤的肌上皮细胞，导致肌上皮细胞群的“衰老”，造成p63的表达显著降低[11]。p63的表达在乳腺癌的进展中是一个逐步缺失的过程。其在正常的乳腺组织中完全表达，导管原位癌中几乎全部表达，浸润性导管癌中大部分缺失[12]。因此，p63的表达缺失与乳腺癌的进展有关。在乳腺癌患者中，p63表达阳性者能够获得更好的预后[13]。既往研究发现，与p63表达阴性的乳腺癌患者相比，化疗前p63表达阳性的乳腺癌患者在新辅助化疗后能够获得更高的pCR率[14]。

本研究患者中，化疗前p63表达阳性的患者区域淋巴结阳性率为65.4%（17/26），p63表达阴性的患者区域淋巴结转移率为82.4%（145/176）。这提示在浸润性导管癌中，p63表达阴性的患者更容易出现区域淋巴结转移。化疗前p63表达阳性的患者术后pCR率为53.8%，高于p63表达阴性患者（32.4%）。这表明p63表达阳性的乳腺癌患者更容易获得pCR。在新辅助化疗前后，p63表达阳性率由化疗前的11.4%上升到化疗后的40.4%。这说明经过新辅助化疗后，部分乳腺癌患者获得了更好的预后。化疗后p63表达阴性转阳性的患者术后pCR率为59.5%，区域淋巴结阳性转阴性率为72.4%；p63表达阳性不变的患者pCR率为44.4%，区域淋巴结阳性转阴性率为50%，显著高于其他患者。这进一步说明新辅助化疗后p63表达阳性的乳腺癌患者获得了更好的预后。

综上所述，在乳腺浸润性导管癌中，p63表达阳性患者的区域淋巴结转移率低，新辅助化疗后pCR率高。化疗后p63表达阳性的患者能够获得更好的预后。Ki-67高表达患者对化疗更敏感。乳腺癌组织p63、Ki-67表达情况的分析对评估乳腺浸润性导管癌患者的病情、新辅助化疗的疗效及预后有一定的价值。