slfn5基因在卵巢癌上皮-间质转化中的作用及机制

徐巧萍 邓魁 林青青 张珍

卵巢癌是女性生殖道最常见恶性肿瘤之一，其发病率和病死率逐年升高。据统计，2015年中国约有52 100例新发卵巢癌病例，病死率高达50%[1-2]。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）指上皮到间质细胞的转化，它赋予细胞转移和入侵的能力，在促进癌症获得转移能力的过程中起重要作用。EMT的分子机制相当复杂，转化生长因子（transforming growth factor,TGF）-β/母体抗生物皮肤生长因子同源蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein,SMAD）、非受体酪氨酸激酶（Janus kinase,JAK）2/信号转导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription,STAT）3、Notch、Ras-促分裂素原活化蛋白激酶（Ras-mitogen-activated protein kinase,Ras-MAPK）、NF-κB和p38等多条分子信号通路均被报道参与调控卵巢癌的EMT过程[3-4]。因此，寻找阻断EMT的信号通路对抑制卵巢癌的侵袭、转移具有重要意义。人类slfn（Schlafen）基因家族有6个成员，其中slfn5基因在肺癌、大肠癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤组织中表达升高，通过激活蛋白激酶（protein kinase,PK）B/糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase,GSK）-3β/β-链环蛋白（β-catenin）通路、抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）14表达来抑制细胞迁移和侵袭[5-6]。Fischietti等[7]推断人类胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）患者的预后较差与slfn5基因高表达有关，这暗示slfn5基因还参与了PDAC的病理生理，并导致预后不良。对人肺癌细胞系A549的研究发现，slfn5基因过表达导致EMT相关转录因子Snail的水平升高，伴随E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达降低，β-catenin从膜向细胞质或细胞核易位[8]，可见slfn5基因是EMT过程中的关键调控分子。深入剖析slfn5基因上下游调控信号通路，探究癌细胞转移机制，可为抑制转移提供新的潜在治疗靶点。本研究以人卵巢癌细胞系为材料，通过沉默slfn5基因，研究slfn5基因在卵巢癌EMT中的作用及其对肿瘤侵袭、迁移能力的影响，探讨EMT标记蛋白和典型转录因子在卵巢癌发生、发展中的作用及机制，以期为卵巢癌治疗提供新线索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织材料 收集2019年8月至2022年4月在杭州市第一人民医院行手术治疗的21例卵巢癌患者的癌组织标本作为卵巢癌组。纳入标准：手术病理检查确诊为卵巢癌且为首次确诊；术前未进行放化疗、靶向治疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤；合并子宫肌瘤、子宫内膜异位症、子宫腺肌病、盆腔炎性疾病；合并重要脏器功能障碍；合并凝血功能障碍、传染性疾病和感染性疾病。另收集同期行良性卵巢囊肿切除的14例患者的正常卵巢组织（距肿瘤组织边缘＞5 cm，经病理检查确认）作为正常组。临床样本正常组年龄38～76（53.22±10.11）岁，卵巢癌组年龄39～75（52.73±12.04）岁。两组年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经杭州市第一人民医院医学伦理委员会审核批准，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.1.2 细胞培养与分组 人卵巢表面上皮细胞IOSE80和卵巢癌细胞系 A2780、SKOV3、OVCAR3、HO8910均购于浙江美森细胞科技有限公司。所有细胞均使用专用培养基，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，隔天换液，待培养瓶底部铺满细胞时传代，取生长状态良好的对数生长期细胞进行后续实验。

1.1.3 主要试剂 Real-time反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，Trizol试剂、Real-time PCR检测试剂盒购自美国Promega公司；DEPC水购自北京索莱宝公司；细胞裂解液试剂盒购自美国Thermo公司；十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；抗SLFN5抗体（批号：6789P）和N-钙黏蛋白（N-cadherin，批号：14215S）、E-cadherin（批号：3195P）、波形纤维蛋白（Vimentin，批号：9585P）、Snail（批号：3879S）、微管蛋白（Tubulin，批号：sc-47778）抗体均购自美国CST公司，β-catenin抗人多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的抗羊IgG、抗兔IgG购自美国CST公司。LipofectamineTM2000转染试剂盒购自上海赛默飞世尔科技有限公司；丙烯酰胺、双丙烯酰胺、二甲基亚砜（DMSO）和磺酰罗丹明B购自美国Sigma公司。

1.2 两组样本组织中slfn5 mRNA表达的检测 将卵巢癌组织和癌旁组织经液氮速冻后剪碎研磨成粉末，采用Trizol法抽提总RNA，采用荧光定量PCR（qRTPCR）法检测mRNA扩增情况。按照逆转录试剂说明书配置逆转录体系，其中RNA模板1 μl，逆转录试剂 14 μl，用 DEPC 水补齐 20 μl。反应条件为 95 ℃预变性 15 min，94 ℃变性30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸30 s，40个循环。每个样品设置3个平行反应孔，实验重复3次，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）为内参，采用 2-ΔΔCt法测定slfn5 mRNA的相对表达量。slfn5引物：正向5'-CATCCGACGCATCACCGATCTG-3'，反 向 5'-CATCCG ACGCATCACCGATCTG-3'；GAPDH引物：正向5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，反向 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 细胞实验及指标测定

1.3.1 5种细胞中SLFN5蛋白表达的检测 采用Western blot法。将5组细胞分别加入细胞裂解液，冰上裂解30 min，离心收集上清液。采用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白水平。样品加入上样缓冲液，根据SDS-PAGE试剂盒方法分离样品，将条带转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜上，加入5%脱脂奶粉封闭1 h，洗膜后加入抗SLFN5一抗孵育过夜。再次洗膜后加入HRP二抗，孵育1 h。洗膜后加入化学发光增强剂，自显影。采用图像分析处理系统（Image J软件）对蛋白条带扫描分析，用测得的蛋白光密度值与Tubulin光密度值的比值表示5组细胞中SLFN5蛋白的相对表达量。

1.3.2 细胞分组、转染及sfln5 mRNA表达的检测 取上述SLFN5蛋白相对表达水平高的2个细胞系用于后续实验。由上海吉凯公司设计并合成特异性沉默slfn5的RNA（si-slfn5#1、si-slfn5#2）及阴性对照（siRNANC），采用LipofectamineTM2000转染试剂盒方法依次转染，即为si-slfn5#1组、si-slfn5#2组和si-NC组，继续培养24 h；si-slfn5#1组、si-slfn5#2组引物序列见表1。取出细胞，采用qRT-PCR法检测各组细胞slfn5 mRNA的相对表达量。

表1 slfn5引物的siRNA序列

1.3.3 细胞迁移能力和侵袭能力的测定 取转染后的细胞作为材料。（1）细胞迁移实验：Transwell小室的下室中加入500 μl含10%FBS的完全细胞培养基，上室接种300 μl不含FBS的细胞悬液（细胞密度约2×104/L）。培养24 h后，甲醇固定Transwell小室的下层细胞，结晶紫染色、清水冲洗，用棉签轻轻拭去上层细胞，10倍显微镜下随机选择5个视野，观察穿过小室滤膜的细胞并计数，细胞相对数量比越大表示细胞迁移能力越强。（2）细胞侵袭实验：在Transwell小室的上室中预先均匀铺上100 μl稀释好的基底胶，37℃静置约2 h，待其凝结成胶后，参照细胞迁移实验进行，观察穿过小室滤膜的细胞并计数，细胞相对数量比越大表示细胞侵袭能力越强。

1.3.4 转染细胞迁移率的检测 采用细胞划痕实验。取转染后的各组细胞制备细胞悬液（约2×104/L），接种于6孔板。当细胞铺满6孔板底部时，用灭菌的移液枪枪头垂直于板底均匀划痕，无菌PBS洗去脱落细胞，于显微镜下观察划痕并拍照记录；继续培养24 h后再次取样拍照。用Image J图像处理软件并测定0 h（T0h）及24 h（T24h）划痕面积，计算细胞迁移率。细胞迁移率=（T0h-T24h）/T0h×100%。

1.3.5 转染细胞中EMT相关蛋白表达的检测 采用Westetn blot法。取各组转染细胞加入细胞裂解液，采用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白水平。样品加入上样缓冲液，根据SDS-PAGE试剂盒方法分离样品，将条带转移到PVDF膜上，加入5%脱脂奶粉封闭1 h，洗膜后分别加入 SLFN5、Vimentin、Snail、N-cadherin 和 E-cadherin等一抗，4℃孵育过夜，加入二抗后室温孵育45 min，显影并用Image J软件进行灰度分析，以Tubulin为内参，计算细胞中Vimentin、Snail、N-cadherin 和E-cadherin等EMT相关蛋白的相对表达量。

1.3.6 转染细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的检测 采用Westetn blot法。取各组转染细胞加入细胞裂解液，参照BCA蛋白浓度测定试剂盒方法测定蛋白浓度；SDS-PAGE分离条带并转模，加入5%牛奶室温封闭1 h，洗膜后加入β-catenin一抗，4℃摇床孵育过夜，加入二抗室温孵育45 min，显影并用Image J软件进行灰度分析，以Tubulin为内参，计算βcatenin蛋白相对表达量。

1.4 统计学处理 采用GraphPad Prism统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组样本组织中slfn5 mRNA表达的比较 相比正常组，卵巢癌组slfn5 mRNA相对表达量明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1 两组样本组织中slfn5 mRNA表达的比较

2.2 5组细胞中SLFN5蛋白表达的比较 与IOSE80相比，HO8910、SKOV3、OVCAR3细胞系SLFN5蛋白均显著高表达，差异均有统计学意义（均P＜0.01），其中SKOV3、OVCAR3相对表达水平更高，见图2。故选取SKOV3、OVCAR3细胞系进行后续实验。

2.3 转染细胞中slfn5 mRNA表达的比较 与si-NC组相比，si-slfn5#1组、si-slfn5#2组细胞中slfn5 mRNA相对表达量均明显降低，差异有统计学意义（均P＜0.01），提示稳定沉默slfn5基因的SKOV3、OVCAR3细胞株构建成功，见图3。

注：Tubulin为微管蛋白；与IOSE80比较，***P＜0.001

图3 转染细胞中slfn5 mRNA表达的比较

2.4 沉默slfn5基因对SKOV3、OVCAR3细胞迁移和侵袭能力的影响 Transwell迁移实验结果显示，相比si-NC组，si-slfn5#1组、si-slfn5#2组穿过基底膜的细胞相对数量比均减小，差异均有统计学意义（均P＜0.01），提示沉默slfn5基因抑制了SKOV3、OVCAR3细胞的迁移。Transell侵袭实验结果显示，相比si-NC组，sislfn5#1组、si-slfn5#2组穿过基底膜的细胞相对数量比均减小，差异均有统计学差异（均P＜0.01），提示沉默slfn5基因抑制了SKOV3、OVCAR3细胞的侵袭，见图4。

图4 沉默slfn5基因对SKOV3、OVCAR3细胞迁移和侵袭能力的影响（a：迁移实验的3组细胞相对数量比；b：侵袭实验的3组细胞相对数量比）

2.5 沉默slfn5基因对SKOV3、OVCAR3细胞迁移率的影响 与si-NC组相比，si-slfn5#1组、si-slfn5#2组的细胞迁移率均显著低于si-NC组，差异均有统计学意义（均P＜0.01），验证了沉默slfn5基因能够降低SKOV3、OVCAR3细胞的迁移能力，见图5。

图5 沉默slfn5基因对SKOV3、OVCAR3细胞迁移率的影响（a：SKOV3、OVCAR3细胞迁移图；b：沉默slfn5基因后，SKOV3、OVCAR3细胞的迁移率）

2.6 沉默slfn5基因对SKOV3、OVCAR3细胞EMT相关蛋白表达的影响 Western blot检测显示，与si-NC组相比，si-slfn5#1组、si-slfn5#2组 Vimentin、Snail、N-cadherin等的相对表达量显著降低，E-cadherin相对表达量显著增加，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。E-cadherin的增加和Vimentin、Snail、N-cadherin的减少与卵巢癌细胞迁移和侵袭能力下降直接相关，提示沉默slfn5基因能抑制卵巢癌细胞发生EMT，见图6。

图6 沉默slfn5基因对SKOV3、OVCAR3细胞EMT相关蛋白表达的影响（a：蛋白电泳图；b-c：沉默slfn5基因的SKOV3、OVCAR3细胞EMT相关蛋白相对表达量）

2.7 沉默slfn5基因对SKOV3、OVCAR3细胞β-catenin表达的影响 与si-NC组相比，si-slfn5#1组、si-slfn5#2组β-catenin相对表达量明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图7。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路关键调控因子，其相对表达量下降提示Wnt/βcatenin信号通路活性降低。

图7 沉默slfn5基因对SKOV3、OVCAR3细胞β-catenin表达的影响（a：蛋白电泳图；b：沉默slfn5基因的SKOV3、OVCAR3细胞βcatenin蛋白相对表达量）

3 讨论

人类slfn（也有称SLFN）家族基因于1998年首次被报道，在免疫系统和恶性肿瘤中起重要作用[1]，并被确认在哺乳动物系统和器官中广泛表达[9-10]。slfn5基因被认为与几种恶性肿瘤的细胞侵袭和转移密切相关，如Mavrommatis等[11]发现slfn5基因高表达可抑制恶性黑色素瘤的锚定非依赖性生长，而敲除slfn5基因则可以增强恶性黑色素瘤细胞侵袭三维胶原的能力。Sassano等[5]研究发现，slfn5通过负调控MMP-1和MMP-13抑制肾癌细胞的迁移和侵袭。slfn5还被认为是一种乳腺癌抑制因子，可通过直接调节乳腺癌转录因子——锌指E盒结合同源框（zinc-finger E-box binding homeobox,ZEB）蛋白1的表达来实现抗癌作用[12]。但slfn5基因对卵巢癌发生、发展的作用还未见报道。本研究检测了23例患者的卵巢癌组织和癌旁组织中slfn5 mRNA的表达水平，结果发现相对于癌旁组织，卵巢癌组织中slfn5 mRNA表达量显著上调。相比卵巢表面上皮细胞，卵巢癌HO8910、SKOV3、OVCAR3细胞系均表现出SLFN5蛋白的高表达，证实了卵巢癌细胞和癌组织中存在slfn5基因表达上调。

肿瘤迁移和侵袭是两个密切相关的病理过程，与肿瘤转移息息相关。卵巢癌转移是影响卵巢癌治疗、预后以及复发的重要因素，因此，对卵巢癌细胞迁移和侵袭的机制研究是卵巢癌研究的重中之重。slfn5基因被证实在控制肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）细胞的运动性和侵袭性方面发挥关键作用[11]。slfn5基因表达促进脑胶质瘤细胞的运动性和侵袭性[13]。本研究表明，沉默slfn5基因可以显著抑制卵巢癌的迁移和侵袭能力。对转染沉默slfn5基因的卵巢癌细胞的划痕实验、Transwell实验结果证实下调slfn5基因抑制了卵巢癌细胞的迁移能力和侵袭能力。沉默slfn5基因后，SKOV3、OVCAR3细胞的迁移、侵袭能力被有效抑制，细胞迁移率显著低于对照组，提示slfn5基因可能通过促进人卵巢癌细胞系的EMT实现细胞迁移和侵袭。

EMT最早是在胚胎发育中发现的一个现象，成体的表皮细胞受到损伤后，也会出现相应的EMT。肿瘤细胞在发生、发展中，常常通过EMT丢失部分上皮细胞的特性来获得一些间质细胞的特性，从而获得更强的侵袭能力[14]。EMT的主要特征包括E-cadherin等上皮标志物表达下降甚至缺失，而间质标志物如N-cadherin、Vimentin蛋白表达的增加[15]。本研究中，沉默slfn5基因后，卵巢细胞系E-cadherin蛋白水平上调，Vimentin、Snail和N-cadherin下调，提示slfn5基因在卵巢癌细胞EMT中起抑制作用。E-cadherin下调导致肿瘤细胞间的黏附性减弱，从而促进了肿瘤细胞的脱落，后者随血液和淋巴转移[3]，被认为是上皮-间质细胞转型的重要特征。N-cadherin是一种神经性钙粘附蛋白，是细胞间动态黏附的重要结构成分，在恶性肿瘤细胞中的表达比正常上皮表型细胞高[16-17]。本研究发现，EMT相关蛋白的表达水平与slfn5基因和SLFN5蛋白的表达水平有关，slfn5基因是EMT过程中的关键调控因子，这为抑制卵巢癌转移提供了新的潜在治疗靶点。

β-catenin是一种多功能蛋白，通过与细胞骨架的相互作用，协助细胞对细胞外的信号和影响作出响应，其典型作用是通过Wnt/β-catenin信号通路激活核内靶基因的表达[18]。EMT过程中，β-catenin介导E-cadherin受体与细胞骨架的附着，该细胞骨架与膜上的E-cadherin结合，完成从膜到核的易位[19]。βcatenin定位于正常上皮细胞和非侵袭性肿瘤细胞的细胞膜中，与E-cadherin分离后在细胞质中积累并在EMT期间转移至细胞核，以激活EMT相关基因的转录，特别是促进Snail和ZEB1等转录因子的表达[20]。本研究构建了沉默slfn5基因的卵巢癌细胞系，Western blot检测发现，相比对照组，转染组细胞中Snail、N-cadherin、Vimentin和 β-catenin显著下调，E-cadherin显著上调。Snail是E-cadherin的公认抑制剂，可直接抑制E-cadherin的转录并诱导EMT，Snail还可以通过诱导E-cadherin阻遏物（如ZEB1）的表达并上调间质标记Vimentin，从而导致上皮细胞黏附力的丧失，诱导EMT并促进细胞迁移，侵袭并最终转移到远处器官[21]。本研究中转染细胞E-cadherin显著高表达，Snail及其他EMT蛋白表达趋势与β-catenin一致，与SLFN5表达趋势一致，提示slfn5可能通过β-catenin-Snail-E-cadherin信号转导来促进肿瘤转移，即slfn5基因可能通过β-catenin介导的Snail/E-cadherin信号通路在EMT和卵巢癌细胞转移中起作用[6]。

作为肿瘤细胞转移的关键步骤，EMT在肿瘤的诊断、分期和治疗中起着重要的作用。利用EMT过程中涉及的分子发现新的肿瘤治疗靶标以及开发新的诊断和治疗药物可能成为癌症早期诊断和治疗的新策略[21]。本研究通过沉默slfn5基因调控EMT相关蛋白的表达，并抑制细胞迁移和侵袭，其机制可能是抑制βcatenin表达，调节了β-catenin介导的Snail/E-cadherin信号通路，从而降低Wnt/β-catenin信号通路活性。