转录因子AP-1抑制剂T5224减轻模型小鼠胆汁淤积性肝损伤

李胜涛，卢卓恒，罗 佳，闫 征，汤治元

(宁波大学 医学院 生理药理学系，浙江 宁波 315211)

胆汁淤积性肝病是由遗传、免疫、感染、药物等因素而导致的胆汁生成、分泌和排泄障碍，胆汁酸在肝内不断淤积，最终反流入血，从而引发的一系列代谢性失调、器质性损害和功能紊乱的肝胆系统性疾病[1]。持续的胆汁淤积引发的炎性反应导致肝细胞损伤，称为胆汁淤积性肝损伤(cholestatic liver injury，CLI)[2]。如果不能有效治疗，会进展为肝纤维化、肝硬化，甚至导致肝衰竭、诱发肝癌[3]。已有的研究表明CLI的发生，主要与中性粒细胞介导的炎性反应有关[4]，然而中性粒细胞介导的炎性反应，及其背后的分子机制仍然不清楚。在α-萘异硫氰酸盐(α-naphthyl isothiocyanate, ANIT)制备的CLI模型中，转录因子激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)通路被活化[5]；另一项研究发现，石胆酸、ANIT制备的两种不同的模型中STAT3通路均被激活[6]，这些研究都是基于相关性分析得出的推测性结论。本研究拟基于AP-1选择性抑制剂T-5224探究和验证转录因子AP-1是否在CLI中发挥关键作用，为探究CLI的发生机制和寻找药物治疗靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

SPF级质量为(25±2)g ICR(Institute of Cancer Research)成年雄性小鼠(上海斯莱克实验动物技术有限公司)；T-5224(APExBIO公司)；Trizol(Omega公司)；α-萘异硫氰酸盐 ANIT(Sigma-Aldrich公司)；玉米油(上海阿拉丁试剂公司)；苏木精染色液、伊红染液、PMSF和RIPA(北京索莱宝科技有限公司)；谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、总胆汁酸(total bile acid，TBA)试剂盒(宁波瑞源生物科技有限公司)；Collagen Ⅰ抗体 (SAB公司)；p-c-Jun(p.phosphorylation)、t-c-Jun(t.total)、p-STAT3、t-STAT3、p-JNK、t-JNK和GAPDH抗体(Abcam公司)；RT 试剂和RT-qPCR试剂(北京康为世纪生物科技公司)；BCA蛋白测定试剂盒(碧云天生物技术公司)；超纯水(Millipore Elix新鲜制备，Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组及处理：将小鼠随机分为对照组(n=5)、胆汁淤积性肝损伤模型组(n=5)和AP-1抑制剂T-5224干预模型组(n=5)。各组小鼠提前禁食12 h，对照组给予玉米油灌胃；胆汁淤积性肝损伤模型组则灌胃给予120 mg/kg的ANIT；T-5224干预组则提前0.5～1 h按100 mg/kg腹腔注射AP-1抑制剂T-5224，24 h后重复给予T-5224。给予ANIT 48 h后，各组称重处死小鼠，通过眼眶采血收集血液，保留肝脏、胆囊等组织。

1.2.2 样本的采集与保存：对小鼠进行眼眶采血，分离血清冰箱冷藏并用于生化分析。收集肝脏、胆囊，用PBS将肝脏清洗干净，取最大肝叶的一半置于10%中性甲醛固定，用于病理分析；剩余肝组织保存于-80 ℃冰箱，用于RT-qPCR及蛋白质分析。

1.2.3 血清生化指标的检测：依据试剂盒中的说明书要求，使测定血清中TBA、AST、ALT、ALP等反映肝损伤和胆汁淤积生化指标。

1.2.4 HE染色观察肝脏组织病理学变化：取出于10%中性甲醛固定的肝组织，按照常规进行脱水、透明、包埋、切片，经HE染色后中性树脂进行封片。将切片置于BX43显微镜(Olympus，日本)镜下，观察肝脏的组织病理学变化。

1.2.5 RT-qPCR检测肝脏炎性因子的表达水平：取20 mg肝脏组织，于研磨机进行破碎，使用Trizol裂解液提取肝脏总RNA，并测定RNA浓度，浓度归一后，依据试剂盒说明书，使用反转录试剂盒进行反转录；将0.1 μL引物(表1)，1 μL cDNA，2.2 μL UltraSYBR混合物和1.6 μL双蒸水加入置96孔板中，进行定量聚合酶链式反应(q-PCR)扩增(LightCycler 480 Ⅱ，Roche，USA)。

表1 荧光实时定量PCR 引物序列

1.2.6 Western blot检测肝组织中c-Fos、c-Jun和STAT3的表达： 取20 mg肝组织，经研磨破碎、蛋白提取，蛋白定量、浓度归一和蛋白变性等处理。经电泳、转膜后，将PVDF膜放入质量为5%的脱脂奶粉中封闭3.5 h，经TBST清洗后，加入p-c-Jun、t-c-Jun、p-STAT3、t-STAT3、p-JNK、t-JNK和GAPDH抗体，在冷房4 ℃孵育过夜。次日，在常温下二抗孵育2.0 h。孵育结束后，使用TBST将膜洗涤洁净，滴加ECL化学发光液，使用化学发光成像系统(ChemiScope 6100 Touch，Shanghai，China)进行曝光并记录图像。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 ANIT和T-5244干预对小鼠胆汁淤积和肝功能的影响

与对照组比较，胆汁淤积性肝损伤模型组的胆囊指数显著上升(P<0.05，表2)。而T-5224干预组的胆囊指数显著下降。在胆汁淤积性肝损伤模型组中，TBA升高37倍，ALP升高38倍，指示肝损伤的指标AST与ALT则分别升高18和4倍(P<0.05)(图1)。小鼠发生胆汁淤积严重，并且伴随有肝损伤发生。与胆汁淤积性肝损伤模型组相比，T-5224干预组胆汁淤积性指标TBA并无明显差异，ALP降低了84%(P<0.05)(图1)，肝损伤的指标AST与ALT则分别下降了63%和76%(P<0.05)(图1)。ANIT造成的胆汁淤积并未得到缓解，但胆汁淤积所造成的肝损伤被抑制。

AST.aspartate aminotransferase; ALT.alanine aminotransferase; TBA.total bile acid; ALP.alkaline phosphatase; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with ANIT group

表2 ANIT和T-5224干预后胆囊和肝脏的变化

2.2 各组小鼠肝组织病理变化情况

对照组小鼠肝组织病理表现无结构异常，无坏死区域；胆汁淤积性肝损伤模型组小鼠肝组织出现大量坏死灶，并伴随着炎性细胞浸润，肝损伤明显； T-5224干预组的肝组织坏死灶相对胆汁淤积性肝损伤模型组有明显减少，肝损伤程度有极大减轻(图2)。T-5224抑制了ANIT对小鼠肝组织的毒性作用，从而减少坏死灶的产生。

A.control group(corn oil treatment);B.ANIT group; C.ANIT and T-5224 combined treat group

2.3 转录因子AP-1与炎性反应

白细胞介素1β、6、10 (IL-1β、6、10) 的mRNA水平在胆汁淤积性肝损伤模型组中显著上升；与对照组相比，胆汁淤积性肝损伤模型组的IL-1β、6、10表达量升高约4.6、4.6、1.3倍。而 T-5224干预组与ANIT相比IL-1β、6、10，明显下降约76%、34%、66% (P<0.05)(图3)。与对照组相比，胆汁淤积性肝损伤模型组的STAT3、JNK、c-Jun的活化水平有明显上升；而与胆汁淤积性肝损伤模型组相比，T-5224干预组的c-Jun、 JNK活化水平均明显下降。从上述结果可以看出，ANIT诱导产生的胆汁淤积性肝损伤过程中发生炎性，其JNK通路被活化。而 T-5224干预组的JNK通路被抑制，肝损伤减少。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with ANIT group

2.4 趋化因子的表达

与对照组相比，胆汁淤积性肝损伤模型组肝脏组织中的Cxcl2、Cxcl10、Ccl2、Ccl5转录水平分别升高45、27、169和2倍(P<0.05)(图4)，出现了明显的炎性反应。与胆汁淤积性肝损伤模型组相比， T-5224干预组Cxcl2、Cxcl10、Ccl2、Ccl5的转录水平则分别下降77%、90%、79%、60%。由ANIT诱导产生的胆汁淤积性肝损伤，在给予T-5224(AP-1抑制剂)后，趋化反应得到了抑制。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with ANIT group

3 讨论

在ANIT干预后的48 h，胆汁淤积性肝损伤模型组的TBA、ALP、AST、ALT水平与对照组相较，均有显著升高，且病理分析的结果表现出现明显的坏死灶，表明小鼠成功被诱导产生胆汁淤积性肝损伤。与胆汁淤积性肝损伤模型组相较，T-5224干预组的肝损伤标志物ALP、AST、ALP明显降低，病理中无明显的坏死灶，肝损伤得到巨大缓解，但胆汁淤积水平TBA并无明显变化。这可能是因为在ANIT诱导产生肝损伤的模型中，AP-1处于炎性反应的下游，抑制剂T-5224对下游的AP-1进行抑制，可以缓解炎性反应，但并不能减少上游的胆汁淤积水平。

已有实验表明，小剂量非诺贝特可以降低小鼠胆汁淤积性肝损伤水平；该治疗作用依赖于PPARα激活，并通过JNK-AP1-CCL2/CXCL2信号抑制趋化作用[8]，然而该实验仅通过生物指标变化的相关性得出结论。本实验，用选择性抑制剂T-5224抑制转录因子AP-1，与胆汁淤积性肝损伤模型组进行对照实验，肝脏炎性损伤却显著降低，说明AP1通路确实介导了小鼠胆汁淤积性肝损伤。

AP-1是JNK下游的一个转录因子，结构上由c-Fos和c-Jun组成的二聚体[9]。它可以通过调节基因的表达来应对细胞因子，生长因子，压力，细菌和病毒感染的刺激；因此AP-1具有控制细胞的进程、分化、增殖、凋亡的功能[10]。而本实验中AP-1与炎性趋化因子同样具有降低的趋势，说明趋化因子CXCL2、CXCL10等受转录因子AP-1的密切调控。STAT3也受到JNK的调控，本研究中胆汁淤积性肝损伤组STAT3也被轻度激活，且在给予T5224后也被轻度抑制。而两个转录因子的上游信号JNK的活化水平被显著抑制。这些结果说明T-5224显著抑制转录因子AP-1，但其也能抑制JNK并进一步抑制STAT3，这一作用也可能对最终的炎性损伤产生一定的贡献。

综上所述，转录因子AP-1介导的趋化反应在胆汁淤积性肝损伤炎性反应中发挥了重要的作用，而STAT3通路对CLI可能只产生微弱的贡献；CXCL2、CCL2等趋化因子都可能趋化中性粒细胞浸润，并在CLI中发挥关键作用。