土槿皮乙酸通过miR-4282抑制人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL-4的增殖

袁 军，韩 虎，董 巍，王瑞仓，郝洪岭*，张学军

(河北省人民医院 1.血液科；2.急诊科，河北 石家庄 050055；3.石家庄市第三医院 心内科，河北 石家庄 050000；4.河北医科大学第二医院 血液内科，河北 石家庄 050055)

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma)是非霍奇金淋巴瘤常见的类型，病发率约占35%左右，具有高度侵袭、转移特性，目前临床治疗方案对弥漫大B细胞淋巴瘤患者难以治愈[1]。中药土槿皮是松科金钱松属植物金钱松[Pseudolarixamabilis(J. Nelson)Rehd]的根皮或近根处茎皮，化学成分含量丰富，土槿皮乙酸(pseudolaric acid B，PAB)是从土槿皮内提出的新型二萜类酸，已在肺癌、肝癌等取得了一定的研究基础[2-3]。研究表明，PAB可能通过下调PAX2抑制宫颈癌细胞转移并诱导凋亡[4]，但是对弥漫大B细胞淋巴瘤研究尚不清楚。miR-4282是非编码RNA的一种转录因子，具有抑制在癌中作用[5]，如在miR-4282在口腔鳞状细胞癌组织和细胞中表达降低，其过表达可抑制细胞增殖、转移，促进凋亡[6]，但是关于miR-4282对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞的研究作用还不清楚。关于PAB和miR-4282调控作用尚不可知，鉴于此，本研究以人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL-4为研究对象，探讨PAB是否通过调控miR-4282的表达影响人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞的增殖和凋亡。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL-4(中科院上海细胞研究中心)；胎牛血清、RPMI-1640培养基(杭州四季青生物科技有限公司)；miR-NC、miR-4282、anti-miR-NC、anti-miR-4282、引物(上海吉玛公司制药技术有限公司)；PAB(纯度≥98%,Sigma-Aldrich公司)；Lipofectamine 2000试剂盒(上海恪敏生物科技有限公司)；Ki-67抗体、cleaved caspase-3抗体、cleaved caspase-9抗体、GAPDH抗体和辣根酶标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Trizol试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒(赛默飞世尔科技公司)；凋亡试剂盒、CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组：将SU-DHL-4细胞用10%胎牛血清的RPMI-1640培养基内，在体积分数为5% CO2、37 ℃培养箱中孵育。取对数期SU-DHL-4细胞接种6孔板，细胞汇合度为70%，用PAB浓度5、10、20 μmol/L培养细胞，记为PAB-L组、PAB-M组、PAB-H组，其中未经PAB处理作为对照组；按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书将miR-NC、miR-4282转染细胞中，记为miR-NC组、miR-4282组；将anti-miR-NC、anti-miR-4282转染细胞中，用20 μmol/L PAB培养细胞，记为(PAB+anti-miR-NC)组、(PAB+anti-miR-4282)组。

1.2.2 CCK8法检测细胞增殖抑制率：取细胞重悬接种96孔板中，按照上述方式处理细胞，培养48 h时每孔中加入10 μL CCK-8试剂，4 h后，用酶标仪在450 nm处检测SU-DHL-4细胞的吸光度值，并计算细胞抑制率。

1.2.3 流式细胞测量术检测细胞凋亡率：培养细胞24 h时，使用PBS洗涤细胞，将细胞调整为1×105个细胞，重悬后依次加入annexin-V- FITC和PI各5 μL，避光环境下孵育15 min，使用流式细胞仪检测各组SU-DHL-4细胞凋亡情况。

1.2.4 Western blot检测Ki-67、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表达：采用RIPA裂解液提取各组SU-DHL-4细胞总蛋白，并使用BCA试剂盒测定纯度，然后通过SDS-PAGE分离等量的蛋白样品，转膜上后利用脱脂奶粉对膜封闭1.5 h，添加cleaved caspase-3、Ki-67、cleaved caspase-9、GAPDH一抗，4 ℃冰箱过夜孵育，加入辣根酶标记的二抗室温孵育1.5h，滴加ECL显色，曝光。应用Quantity One分析蛋白条带吸光度值，以GAPDH作为内参。

1.2.5 RT-qPCR检测miR-4282表达：1 mL Trizol提取细胞总RNA，检测RNA浓度和纯度，反转录合成cDNA模板，配置Premix Taq 12.5 μL，2.0 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL，双蒸水9.5 μL，进行扩增。使用2-△△Ct法计算miR-4282相对表达量，用U6作为内参基因。miR-4282上游引物: 5′-ATGTG GCAGATCCCACAGGAGTTT-3′，下游引物: 5′-ACT GGGTTTGACTTCGTAGCCCTT-3′；U6上游引物： 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，下游引物: 5′-TGC CGTAGGTGTCCCTTTG-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 PBA对SU-DHL-4细胞增殖及蛋白Ki-67表达的影响

PAB-L组、PAB-M组、PAB-H组SU-DHL-4细胞抑制率显著高于对照组，蛋白Ki-67表达显著低于对照组(P<0.05)(图1，表1)。

表1 PBA对SU-DHL-4细胞抑制率及蛋白Ki-67表达的影响

图1 Ki-67蛋白表达

2.2 PBA对SU-DHL-4细胞凋亡及蛋白leaved caspase-3、cleaved caspase-9表达的影响

PAB-L组、PAB-M组、PAB-H组与对照组相比，凋亡率、蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达显著升高(P<0.05)(表2,图2)。

A.apoptosis-related protein expression; B.flow cytogram of apoptosis

表2 PBA对SU-DHL-4细胞凋亡率及蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达的影响

2.3 PBA对SU-DHL-4细胞miR-4282表达的影响

与对照组相比，PAB-L组、PAB-M组、PAB-H组miR-4282相对表达水平显著增加(P<0.05)(表3)。

表3 PBA对SU-DHL-4细胞miR-4282表达的影响

2.4 miR-4282过表达对SU-DHL-4细胞增殖和凋亡的影响

与miR-NC组相比，miR-4282组miR-4282相对表达量显著增加(P<0.05)，细胞抑制率、凋亡率显著增加(P<0.05)，Ki-67蛋白表达显著降低(P<0.05)，蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达明显升高(P<0.05)(图3，表4)。

A.expression of proliferation and apoptosis-related proteins; B.flow cytometry of apoptosis

表4 miR-4282过表达对SU-DHL-4细胞增殖和凋亡的影响

2.5 抑制miR-4282表达减轻了PBA(20 μmol/L)对SU-DHL-4细胞增殖和凋亡的影响

与PAB+anti-miR-NC组相比，PAB+anti-miR-4282组miR-4282相对表达量显著降低(P<0.05)，细胞抑制率、凋亡率显著降低(P<0.05)，Ki-67蛋白表达显著增加(P<0.05)，蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达明显下降(P<0.05)(图4，表5)。

A.expression of proliferation and apoptosis-related proteins; B.flow cytometry of apoptosis

表5 抑制miR-4282表达减轻了PBA对SU-DHL-4细胞增殖和凋亡的作用

3 讨论

研究显示，PAB对癌细胞有增殖抑制和凋亡促进的作用[7]。PAB可促进人肾癌细胞A498凋亡[8]。在胰腺癌研究中PAB呈剂量依赖抑制胰腺癌细胞增殖和促进细胞凋亡[9]。还有研究发现，PAB促进宫颈癌细胞凋亡[10]。以上说明PAB具有良好的抗肿瘤作用，但对弥漫大B细胞淋巴瘤研究不清楚。因此，本研究使用不同浓度PAB处理人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL-4。结果显示，细胞抑制率、凋亡率呈剂量依赖性增加，Ki-67蛋白表达降低，cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白增加,提示PAB可抑制SU-DHL-4细胞增殖和促进凋亡。

微RNA(microRNA,miRNA)广泛存在真核细胞中，在不同组织或细胞内差异表达，起着促癌或抑癌的作用，且参与细胞发育、增殖、凋亡等过程[11-12]。miR-4282是一种抑癌基因，在乳腺癌组织和细胞中下调表达，具有抑制细胞的增殖、转移并诱导凋亡的作用[13]。在胰腺癌研究中发现，miR-4282在胰腺癌组织和细胞中低表达，与淋巴结转移和远处转移有关，过表达miR-4282可抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭[14]。在结直肠癌研究中发现，miR-4282表达降低，过表达miR-4282能有效抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移[15]。提示miR-4282在肿瘤中起着抑制作用，但是关于miR-4282在人弥漫大B细胞淋巴瘤中的研究尚不清楚。本研究结果显示，PAB处理SU-DHL-4细胞后，miR-4282表达增加，过表达miR-4282抑制SU-DHL-4细胞增殖和促进凋亡。进一步实验结果表明，抑制miR-4282表达可减弱PAB对SU-DHL-4细胞增殖和凋亡的作用，提示PAB通过调控miR-4282影响人弥漫大B细胞淋巴瘤发生。

综上所述，PAB可能通过调控miR-4282促进人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系凋亡，抑制其增殖。本实验研究还存在不足之处，如对于miR-4282可能相关的靶基因及体内动物实验还需要后续实验探究。