三七总皂苷对小鼠巨噬细胞炎性反应的影响

范盎然 于雪 王旭 王淑艳 陈紫微 魏鹏

摘要 目的：观察三七总皂苷（PNS）对小鼠巨噬细胞炎性反应的治疗作用，同时探讨其可能机制。方法：通过蛋白质免疫印迹实验、实时PCR法、酶联免疫吸附试验，对照研究PNS对小鼠巨噬细胞系RAW 246.7细胞中炎性反应调控因子过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPAR-α）以及其下游调控的炎性反应递质肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、C反应蛋白（CRP）和重组人巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），白细胞介素6（IL-6），炎性反应相关氧化因子诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧化酶-2（COX-2）表达的影响。结果：小鼠巨噬细胞炎性反应模型制备后TNF-α、CRP、M-CSF、IL-6、iNOS及COX-2水平明显上调，三七总皂苷给药后，细胞炎性反应递质与造模组比较有显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：三七总皂苷可明显抑制小鼠巨噬细胞炎性反应效应，其作用机制可能通过激活调控因子PPAR-α实现。

关键词  巨噬细胞;炎性反应模型;小鼠;三七总皂苷;机制;过氧化物酶体增殖物激活受体-α;炎性调控因子;炎性相关氧化因子

Effects of Panax Notoginseng Saponins on Macrophage Inflammation in Mice

FAN Angran，YU Xue，WANG Xu，WANG Shuyan，CHEN Ziwei，WEI Peng

（School of Traditional Chinese Medicine，Beijing University Of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To observe the therapeutic effects of Panax notoginseng saponins（PNS）on macrophage inflammation in mice and to explore its possible mechanism.Methods：By Western Blotting test，Real-time PCR method and Elisa test，the effects of PNS on the expression of inflammatory regulatory factors PPAR-α，TNF-α，CRP and M CSF，IL 6，iNOS and COX-2 in mice macrophages were comparatively studied.Results：After the establishment of mouse macrophage inflammation model preparations，the concentrations of TNF-α，CRP，M CSF，IL 6，iNOS and COX-2 were significantly up-regulated.After administration of Panax Notoginseng Saponins，the levels of inflammatory factors were significantly lower than those in the model group，and the differences are statistically significant（P<0.001）.Conclusion：Panax notoginseng saponins could significantly inhibit the inflammatory effects of macrophages in mice，and its mechanism may be realized by activating the regulatory factor PPAR-α.

Keywords Macrophage; Inflammation model; Mouse; Panax Notoginseng Saponins; Mechanism; PPAR-α; Inflammatory regulatory factor; Inflammatory related oxidative factor

中圖分类号：R282.6;R273 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.002〖HK〗

在血管中，慢性炎性反应是引起单核-巨噬细胞募集，继而产生泡沫细胞的主要原因。主要由单核细胞被炎性反应递质募集、巨噬细胞进入动脉壁炎性反应破损处并分泌释放更多的炎性反应递质和炎性反应相关氧化因子，使得低密度脂蛋白（LDL）被氧化成为氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）、巨噬细胞摄取ox-LDL成为泡沫细胞死亡形成斑块脂质核几个过程组成。故而抑制这一最初的炎性反应在动脉粥样硬化的防治中显得尤为重要，抑制巨噬细胞炎性反应成为预防和治疗动脉粥样硬化方法[1-4]。

三七是临床常用的中药材，具有活血化瘀、消肿止痛的作用，临床广泛用于心脑血管疾病的治疗[5-6]。三七总皂苷是三七的有效活性成分，临床不少其有效治疗动脉粥样硬化的报道，但其作用机制目前尚无统一定论。我们以小鼠巨噬细胞系RAW 246.7作为模型，用动脉粥样硬化危险因子ox-LDL造成巨噬细胞炎性模型，检测抗动脉粥样硬化因子过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α），炎症递质肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、C反应蛋白（CRP）和重组人巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、白细胞介素6（IL-6），炎性相关氧化因子诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧化酶-2（COX-2），并采用检测炎性反应递质TNF-α，试剂盒法检测三七总皂苷对ox-LDL刺激RAW 246.7细胞的NO释放的影响，由此探讨三七总皂苷（Panax Notoginseng Saponin，PNS）的抗炎作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

小鼠巨噬细胞系RAW 246.7细胞，购自中国科学院上海细胞库。数量：1×106个，以10% DMEM+90%胎牛血清冻存于液氮。

1.1.2 药物

三七总皂苷，购自北京百诺威公司，批号：110870，共100 mg。

1.1.3 试剂及仪器

DMEM高糖细胞培养基（Hyclone，批号：MD207-050），FBS胎牛血清（PAA，批号：FBS500-S），ox-LDL（北京协生生物科技有限责任公司，批号：38293）及LDL（北京协生生物科技有限责任公司，批号：31342），SYBR Green realtime PCR混合液（Takara，日本，批号：RR420A）。自动平衡离心机（湘仪公司，TDZ5-W型），CO2细胞培养箱（日本SANYO公司，BC-J80/160S型），单人净化工作台（苏州净化，SW-CJ-1BU型），DU800核酸蛋白测定仪（BECKMAN COULTER，美国，DU800型），荧光定量PCR仪（ABI，美国，7300型），微孔板化学发光检测仪（Berthold，德国，OrionII型），冷冻离心机（SIGMA，美国，Sigma3K15型），Trizol（Invitrogen，美国，批号：15596-026），逆转录试剂盒（Toyobo，日本，批号：QRA-201）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

将小鼠巨噬细胞系RAW264.7用含10%胎牛血清的DMEM培养基，放置在37 ℃，5% CO2培养箱中培养，取对数期细胞用于实验。传代接种于6孔细胞培养板中，待细胞稳定融合至80%时，培养液中加入ox-LDL，使其终浓度为50 μg/mL。

1.2.2 给药方法

将成模细胞分为2组，模型组及给药组，将PNS预先加入到完全培养基中干预1 h，预先加入到完全培养基中干预1 h，随后加入给药组RAW264.7孵育8 h，每组设复孔。

1.2.3 检测指标及方法

酶联免疫吸附试验检测TNF-α、CRP、IL-6、iNOS和COX-2表达水平变化：干预结束后收集细胞上清液，置离心管中用2 000 r/min离心20 min，吸取上清液，用酶联免疫吸附试验检测TNF-α、CRP、IL-6、iNOS和COX-2蛋白的水平，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

蛋白质免疫印迹检测PPAR-α、M-CSF蛋白水平变化：干预结束后收集细胞，加入适量的细胞裂解液，室温下静置10 min后将细胞置于4 ℃ 2 000 r/min离心20 min，取出上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物公司，批号：2839392）测定各样本的蛋白浓度并计算出上样量。经电泳SDS-PAGE凝胶将目的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），滴加PPAR-α、M-CSF及β-actin一抗（购自美国CST公司，浓度均按照1∶1 000稀释），脂奶粉封闭PVDF膜2 h，用PBS洗涤PVDF膜3次，5 min/次，加入HRP-二抗，置于室温轻摇1 h后取出再用PBS洗涤3次。最后进行曝光、显影、定影、拍照和统计分析。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 5统计软件分析，检测数据用均数±标准差（±s）表示，组间采用单因素方差（One-Way ANOVA）分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三七总皂苷给药后细胞炎性反应递质的变化

造模后，细胞中的炎性反应递质TNF-α、CRP和M-CSF、IL-6，炎性相关氧化因子iNOS和COX-2表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），而三七总皂苷给药后，细胞炎性反应递质与造模组比较显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。見图1。

2.2 三七总皂苷给药对细胞炎性反应递质TNF-α蛋白水平的影响

PNS给药后，RAW264.7细胞中的炎性反应递质TNF-α蛋白比较模型组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

2.3 三七总皂苷给药对细胞NO释放量的影响

炎性刺激下，细胞对NO的释放量升高，而PNS可以有效地使RAW264.7的NO释放水平降低，趋于正常。见图3。

2.4 三七总皂苷给药后细胞炎性调控因子PPAR-α的变化

RAW264.7在受到刺激产生炎性反应时，伴随炎性调控因子PPAR-α的表达显著下调，差异有统计学意义（P<0.05），而给予PNS治疗后，炎性调控因子PPAR-α的表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

慢性炎性反应是一个重要的公共健康问题，是多种疾病的潜在诱因，它引发的疾病可累积多个器官。如发生在血管的慢性炎性反应，是动脉粥样硬化（AS）的重要诱因。由于其发展时间长，病程缓慢，慢性炎性反应往往不容易被人所察觉。在治疗上，现代医学采取的抗炎消炎治疗并不能很好的解决此类炎性问题，还会带来各种不良反应，严重降低患者的满意度，不适宜长期使用。近年来，中医药得到了广泛的普及。三七是其中最常用的中药，因为它的作用已被多个实验证实：如促进血液

循环、血管保护[7]，神经功能改善[8]，降低氧化应激[9]，以及抗炎作用。三七总皂苷（Panax Notoginseng Saponin，PNS）是三七的主要有效成分。动物实验表明，PNS在心血管疾病中具有重要的作用[10-11]。现在它的部分产品可作为在中国和世界范围内的非处]方药。

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