IL-35对可溶性CD40配体诱导血管内皮细胞损伤的影响

李 明，孙海玲，刘娟利，郭巍巍

(南京医科大学康达学院附属滨海县人民医院 1.检验科； 2.介入与血管外科， 江苏 盐城 224500)

深静脉血栓(deep venous thrombosis, DVT)是血液在深静脉非正常凝结，属于静脉回流障碍性疾病，多发于下肢、肠系膜、以及骨盆等[1]。患者易罹患血栓后综合征，局部组织肿胀、疼痛。DVT的启动涉及血流停滞、血液促凝成分增加、以及血管内皮细胞损伤[2]，其中可溶性CD40配体(soluble CD40L, sCD40L)等炎性物质诱导的血管内皮细胞损伤与血栓的形成密切相关[3]。白细胞介素(interleukin, IL)-35是一种新型的异二聚体抗炎因子，能有效抑制多种炎性物质(如脂多糖、脂质溶血磷脂酰胆碱)诱导的内皮细胞活化[4-5]。但其对sCD40L损伤血管内皮细胞的影响缺乏报道。本研究通过检测DVT患者外周血IL-35和sCD40L的水平，并通过体外实验分析IL-35对sCD40L损伤血管内皮细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 资料

1.1.1 对象：研究对象为2020年1月至2020年12月于滨海县人民医院诊治的急性期DVT患者30例(DVT组)，诊断标准符合第3版《深静脉血栓形成的诊断和治疗指南》[6]。同时选取性别、年龄匹配的健康体检者30名作为对照组(HC组)，两组性别、年龄差异无统计学意义。本研究经过滨海县人民医院伦理委员会批准(批准号2020/01)，研究对象均签署知情同意书。

1.1.2 细胞及试剂：人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)及细胞培养液(湖北武汉丰晖生物技术有限公司)；IL-35、sCD40L、IL-1β、IL-18、sCD40L ELISA试剂盒、鼠抗人β-actin、羊抗兔及羊抗鼠二抗(南京翼飞雪生物技术有限公司);IL-35(Sigma-Aldrich公司)；兔抗人GSDMD-N、cleaved caspase-1等抗体(CST公司)；蛋白浓度试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集：均于空腹治疗前采集静脉血5 mL，1 500 r/min，离心5 min收集血清，使用ELISA试剂盒检测血清中IL-35、sCD40L、IL-1β、IL-18等细胞因子的水平。

1.2.2 细胞的培养及分组：将HUVECs接种于DMEM完全培养基中，置于37 ℃，5% CO2培养箱，待其增殖至80%汇合时传代，第2～5代用于实验。分为对照组、sCD40L组和IL-35组。sCD40L组：加入25 μg/mL sCD40L；IL-35组：加入20 ng/mL IL-35和25 μg/mL sCD40L。

1.2.3 CCK8试剂盒检测细胞活力：将HUVECs以2×103个/mL接种至96孔板，加入10 μL 的CCK8试剂，37 ℃培养2 h后，使用酶标仪检测各孔吸光度值(A值)，波长为450 nm。

1.2.4 ELISA检测细胞培养上清中IL-1β和IL-18浓度：收集细胞培养上清液，按试剂盒说明书检测上清液中IL-1β和IL-18细胞因子的浓度。

1.2.5 Western blot检测细胞中GSDMD-N、cleaved caspase-1蛋白表达：使用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。通过10% SDS-PAGE分离蛋白质并转移至PVDF膜上，上样浓度为30 μg。使用5%脱脂牛奶封闭2 h后加入GSDMD-N、cleaved caspase-1一抗4 ℃ 孵育过夜，TBST摇床清洗3次，每次10 min，加入二抗室温1 h后清洗3次，每次10 min，加入显影液使用Bio-Rad凝胶成像仪显影成像。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 两组外周静脉血细胞因子水平比较

与HC组比较，DVT组IL-35水平显著降低，sCD40L、IL-1β、IL-18水平显著升高(P<0.05)(表1)。

表1 外周血清细胞因子水平比较

2.2 DVT患者外周血IL-35和sCD40L相关性分析

DVT患者外周血IL-35和sCD40L水平呈负相关(r=-0.501，P<0.05)(图1)。

图1 DVT患者外周血IL-35与sCD40L水平相关性分析

2.3 三组HUVECs活力比较

与对照组比较，sCD40L组细胞活力降低；与sCD40L组相比，IL-35组细胞活力上升(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with sCD40L group

2.4 三组HUVECs培养上清IL-1β和IL-18水平比较

与对照组相比，sCD40L组HUVECs培养上清IL-1β和IL-18水平显著升高；IL-35组与sCD40L组相比，HUVECs培养上清IL-1β和IL-18的水平显著降低(P<0.05)(表2)。

表2 HUVECs培养上清IL-1β和IL-18水平比较

2.5 三组HUVECs中GSDMD-N、cleaved caspase-1蛋白表达比较

与对照组相比，sCD40L组GSDMD-N、cleaved caspase-1蛋白表达显著升高；与sCD40L组相比，IL-35组显著降低(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with sCD40L group

3 讨论

深静脉血栓形成机制涉及血管内皮细胞的激活、血小板的活化以及免疫细胞的募集等[7]。免疫系统参与血栓形成和消除，机制是促炎/抑炎细胞因子的失衡，具有促进炎性反应作用的细胞因子IL-6、TNF-α、C反应蛋白表达显著升高，具有抑制炎性反应的细胞因子IL-10、IL-4表达显著降低[8-9]。sCD40L是CD40L的一个可溶性的三聚体片段，由多种免疫细胞产生， 但主要由活化的血小板分泌，sCD40L促进血管内皮细胞活化，具有促炎、促凝作用，导致血栓形成[10]。

IL-35主要是由调节性T细胞(regulatory T cells Treg)分泌的抑炎细胞因子，其主要功能是抑制Th17细胞的分化和发育，保护血管内皮细胞。在自身免疫性疾病和炎性疾病中发挥着重要的调节作用[11]。本研究发现DVT患者外周血IL-35浓度降低，与本研究结果一致的是，恶性肿瘤、感染、系统性红斑狼疮患者易形成静脉血栓，而文献已证明此类患者血清IL-35浓度降低[12]。

血流停滞导致局部低氧[13]，低氧能够诱导血管内皮细胞NLRP3炎性小体的活化[14]，参与深静脉血栓的形成。NLRP3炎性小体由NLRP3、ASC、caspase-1组成，激活的caspase-1裂解GSDMD成具有活性的GSDMD-N，导致细胞内膜产生孔隙，细胞肿胀、裂解，释放炎性因子IL-1β、IL-18[15]。本实验通过体外实验证明，IL-35能显著降低sCD40L诱导的HUVECs活力损伤、IL-1β和IL-18的产生、cleaved caspase-1和GSDMD-N蛋白表达。

综上所述，深静脉血栓患者外周静脉血IL-35水平显著降低，sCD40L水平显著升高，两者呈负相关。体外实验结果表明IL-35对sCD40L诱导的血管内皮细胞损伤具有保护作用，其机制是抑制血管内皮细胞cleaved caspase-1和GSDMD-N的表达，降低血管内皮细胞IL-1β、IL-18的释放，从而影响血栓的形成。但深静脉血栓患者IL-35和sCD40L变化的机制尚需要进一步研究。