白藜芦醇缓解低氧/复氧诱导的TCMK1细胞线粒体自噬

江罗佳，许海波

(九江市第一人民医院 1.肾内科； 2.肝病科，江西 九江 332000)

细胞内的线粒体在质量或数量上都时刻发生着动态变化。当机体遭受应激损伤时，会产生大量结构或功能缺陷的线粒体[1]。线粒体自噬，是一种高度保守的细胞活动，它能及时清除受损的线粒体，对控制线粒体质量、改善线粒体功能、维持细胞稳态至关重要[2]。据报道，线粒体自噬在脏器遭受缺血/再灌注(ischemic-reperfusion，I/R)损伤早期就开始启动。当抑制线粒体自噬时，会严重加剧I/R诱导的脏器病理损伤[3]。

白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种具有多种生物学活性的多酚类化合物，是天然的自由基清除剂及抗炎剂[4]。研究表明，Res能通过抑制间充质转分化及炎性反应通路治疗肾损伤[5]，Res能抑制氧化应激引起的足细胞凋亡[6]等。此外， Res能够通过抑制线粒体自噬的相关通路来缓解动物模型中的肌营养不良症、年龄衰老、动脉血管硬化，脑损伤等[7-9]。结合上述，Res的肾脏保护作用可能与促进线粒体自噬，维持线粒体动力学稳态相关，本该研究通过Res的药效学试验，检测线粒体功能的指标，以及对线粒体自噬的观察，探讨Res对体外低氧/复氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)损伤后小鼠肾小管上皮细胞系TCMK1中氧化应激、细胞凋亡的影响，为线粒体自噬在I/R诱导急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的机制上提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠肾小管上皮细胞系TCMK1(ATCC细胞库)；最低基本(MEM)培养基(高糖型)、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(Hyclone公司)；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白检测试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)；视神经萎缩症蛋白(optic atrophy, OPA)抗体、动力相关蛋白(dynamin-related protein, Drp)抗体和cleaved caspase-3抗体(CST中国公司); Bax抗体和Bcl2抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；活性氧(reactive oxygen species, ROS)和钙离子(Ca2+)含量检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；线粒体外膜转位酶20(TOMM20)抗体和自噬溶酶体相关膜蛋白2(autophagy-lysosome-associated membrane proteins 2, LAMP2)抗体(杭州华安生物技术有限公司)；线粒体自噬抑制剂1 (mitochondrial division inhibitor 1, Mdivi-1(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组与处理：TCMK1细胞在10% FBS的MEM培养基中培养，37 ℃培养箱中孵育。将对数增殖期的细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，分为对照组、H/R组和H/R+不同剂量(0、5、10、20、50、100和500 μmol/L)Res预处理组(预处理细胞2 h)，或H/R+Res+Mdivi-1干预组(10 mmol/L预处理细胞2 h)。对照组细胞在正常环境培养，H/R组细胞在H/R条件(5%胎牛血清+低氧12 h+复氧24 h)刺激培养(其中低氧条件为1% O2+5% CO2+95% N2；复氧条件为 76% N2+5% CO2+21% O2)。

1.2.2 CCK-8 法检测细胞活力：将TCMK1细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，孵育培养24 h，分组干预完成后加10 μL CCK-8溶液，37 ℃培养箱孵育1h，利用酶标仪检测450 nm处测吸光度(A)值。细胞活力计算公式：细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)]。

1.2.3 ROS含量的检测：利用试剂盒DCFH-DA荧光探针法检测TCMK1细胞内ROS含量。细胞经过分组处理后，收集各组细胞至流式管中，PBS轻柔洗涤2遍，根据说明书加入10 μmol/L的DCFH-DA探针并置于37℃培养箱避光孵育，孵育30 min结束后基础培养基轻柔洗涤3次，采用流式细胞仪检测细胞ROS荧光。

1.2.4 细胞内Ca2+含量的检测：利用试剂盒荧光染料Fluo-3/AM荧光探针法检测TCMK1细胞内Ca2+含量。细胞经过分组处理后，PBS轻柔漂洗2遍，加入Fluo-3/AM工作液并于37 ℃孵育箱避光孵育30 min，结束后PBS轻柔洗涤3次，荧光显微镜下观察拍照。

1.2.5 MMP的检测：利用JC-1线粒体膜电位试剂盒检测TCMK1细胞内MMP下降程度。细胞经过分组处理后，收集各组细胞至流式管中，根据说明书加入JC-1荧光探针并置于37 ℃培养箱避光30 min，PBS轻柔洗涤2次，流式细胞仪检测细胞内MMP变化。

1.2.6 细胞免疫荧光双染检测细胞内线粒体自噬：取对数增殖期的TCMK1细胞1×105个/孔接种于6孔板中的细胞爬片上，培养24 h后细胞分组并处理，PBS轻柔漂洗3次，4%的多聚甲醛固定爬片20 min，PBS轻柔漂洗3次，0.5% Triton X-100室温通透20 min，PBS轻柔漂洗3次，在玻片上滴加5% BSA，37 ℃封闭30 min，PBS轻柔漂洗3次，加入1∶200稀释LAMP2和1∶1 000 TOMM20一抗，4 ℃保湿盒内避光孵育过夜，PBS轻柔漂洗3次，绿色DyLight488荧光标记的山羊抗兔二抗以1∶100稀释，37 ℃避光孵育30 min，DAPI复染10 min，全自动显微镜进行观察拍照。

1.2.7 Western blot检测OPA和DRP蛋白的表达：取对数增殖期的TCMK1细胞1×105个/孔接种于6孔板中的细胞爬片上，培养24 h后细胞分组并处理，加RIPA试剂(含cocktail酶抑制剂)提取TCMK1细胞的蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白浓度测定，再按各组蛋白相同的上样量行SDS-PAGE。电泳后，将分离蛋白转移至PVDF膜，并于5%脱脂奶粉溶液中封闭1 h。然后分别置于含有OPA(1∶1 000)、DRP(1∶1 000)、cleaved caspase-3(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)和Bcl2(1∶1 000)抗体稀释液中，在4 ℃层析柜中低速摇床上孵育过夜。次日将条带置于TBST中洗脱一抗3次，置于山羊抗兔(1∶2 000)抗体稀释液中，室温下二抗孵育1 h，再将条带置于TBST中洗脱二抗3次，滴加新鲜显影液曝光显影。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Res安全浓度的筛查

与对照组相比，Res在5～20 μmol/L时，细胞活力无显著下降；但随着浓度的持续增加(50～500 μmol/L)，细胞活力显著下降(P<0.01)(表1)。因此本研究选择5、10、20 μmol/L这3个浓度作为Res的低、中、高3个浓度组。

2.2 Res对H/R损伤后TCMK1细胞存活率的影响

与H/R组相比，给予Res(5、10、20 μmol/L)预处理后，细胞存活率均升高，以10 μmol/L Res+H/R组中细胞存活率升高至98.24%最显著(P<0.05)。因此，选取10 μmol/L Res作为最佳作用浓度用于后续实验(表2)。

表2 Res对H/R损伤后TCMK1细胞存活率的影响

2.3 Res对H/R损伤后TCMK1细胞钙离子及ROS的影响

对照组细胞内Ca2+(绿色荧光)含量较少，而H/R组细胞数目减少且Ca2+(绿色荧光)含量显著增多(P<0.05)，H/R+Res组细胞数目增多且Ca2+(绿色荧光)含量显著减少(P<0.05)(图1A,B)。与对照组相比，H/R组细胞内ROS荧光强度显著增多(P<0.05)；与H/R组相比，H/R+Res组细胞内ROS荧光强度显著降低(P<0.05)(图1C,D)。

A,B.fluorescence microscopy to detect intracellular calcium fluorescence; C,D.flow cytometry to detect percentage of reactive oxygen species positive cells; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H/R group

2.4 Res对H/R损伤后TCMK1细胞MMP的影响

对照组细胞内MMP无降低，表现为红色荧光较弱；与对照组相比，在H/R组MMP显著降低，红色荧光增多(P<0.05)；而与H/R组相比，给予(H/R+Res)预处理组，下降的MMP有所恢复，红色荧光减少(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H/R group

2.5 Res对H/R损伤后TCMK1细胞动力学蛋白表达的影响

与对照组相比，H/R组OPA蛋白表达下降，而DRP蛋白表达升高(P<0.05)；与H/R组相比，给予Res干预后，OPA蛋白表达显著升高，而DRP蛋白显著下降(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H/R group

2.6 免疫共定位观察各组线粒体自噬情况

观察TOMM20(红色)和LAMP2(绿色)的共定位情况(箭头指示自噬线粒体)，可见H/R组和(Res+H/R)组线粒体数量较对照组组均有不同程度减少，且(Res+H/R)组共定位的线粒体数量较H/R组明显增多(图4)。

图4 免疫共定位观察各组线粒体自噬情况

2.7 Mdivi-1对H/R损伤后TCMK1细胞凋亡的影响

与对照组相比，H/R组cleaved caspase-3、Bax蛋白表达显著升高，Bcl2蛋白表达显著降低(P<0.05)；与H/R组相比，给予Res干预后，cleaved caspase-3、Bax蛋白表达显著下降，Bcl2蛋白表达显著升高(P<0.05)；与(H/R+Res)组相比，在其基础上给予Mdivi-1干预后能够显著增加cleaved caspase-3、Bax蛋白表达，显著降低Bcl2蛋白表达(P<0.05)(图5A～E)。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with H/R group；△P<0.05 compared with H/R+Res group

3 讨论

机体在遭受休克、手术时不可避免会发生肾脏I/R损伤，导致急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)发生。迄今，国内外尚无预防和治疗缺血性AKI的有效药物。由于肾脏细胞属于非再生细胞，发生AKI后整体预后较差。因此，探索新型有效的预防和治疗AKI的药物是学术领域研究的热点。

目前，肾脏I/R损伤的分子机制尚不完全清楚，皮髓质交界处近端肾小管上皮细胞对缺血低氧敏感，是缺血性AKI的主要靶细胞[10]。线粒体能够提供细胞生命活动的主要能量，是决定缺血后肾小管细胞生存和死亡的关键靶区[11]。当肾脏发生I/R损伤时，出现细胞内能量耗竭，ROS产生，钙离子超负荷等，诱导线粒体功能障碍。而受损的线粒体亦会成为加重I/R损伤的继发性因素[12]。本研究证实，Res能够减轻H/R造成的钙离子超负荷、ROS聚集以及MMP的降低，表明Res的肾小管保护功能与改善线粒体功能密切相关。

线粒体的质量控制，如线粒体融合、线粒体分裂与线粒体自噬，既能保护线粒体免受应激损害，又能选择性清除功能或结构障碍的线粒体[13]。近年，线粒体自噬在肾脏病中的研究受到很多关注。线粒体自噬对调控线粒体动力学平衡，促进肾小管上皮细胞的修复极为重要[14]。本研究结果发现，给予H/R刺激干预后线粒体融合蛋白OPA表达减少，而分裂蛋白DRP表达增多，表明H/R会诱导TCMK1细胞线粒体动力学失衡，而给予Res预处理后能够逆转这一现象，提示Res能够调控线粒体动力学稳态来维持线粒体形态正常。Mdivi-1是细胞自噬抑制剂1，其作用主要是抑制细胞或亚器官(如线粒体)自噬的行为[15]。深入研究发现，Res促进线粒体和LAMP2蛋白的共定位发生，提示Res能够促进线粒体自噬发生，而给予Mdivi-1会加重TCMK1细胞中凋亡执行蛋白表达，表明Res能通过调控线粒体自噬对调控线粒体动力学平衡，促进TCMK1细胞的修复，与既往文献报道相符合[16]。

综上所述，Res对H/R诱导TCMK1细胞损伤的保护作用可能与激活线粒体自噬途径，清除结构或功能缺陷的线粒体，改善线粒体质量密切相关。本研究为Res在I/R诱导的AKI方面提供一定的理论依据。但是，有关Res在体内实验剂量和效果的验证，仍需要进一步的深入研究。