同时产碳青霉烯酶NDM-1和NDM-5的猪源大肠埃希氏菌的鉴定及耐药性研究

李海利 郎利敏 张青娴 游一 朱文豪 王治方 张立宪 王克领

（河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，郑州 450002）

产房仔猪腹泻一直是养猪生产中危害仔猪的一种严重的消化道疾病［1］，在集约化规模化猪场、中小规模猪场以及农村散养户猪场，产房仔猪腹泻不仅导致仔猪生长缓慢，料报酬低、体型大小不一致，料肉比升高，成为僵猪甚至死亡，而且死亡率高，能达到100%死亡率。这严重影响了猪场的经济效益和运营状况，给养猪业带来极大的危害和造成重大的经济损失。引起产房仔猪腹泻的原因主要有以下几个方面：细菌、病毒、寄生虫、应激、霉菌等因素。其主要原因为大肠杆菌引起的黄白痢和断奶仔猪腹泻。

随着养猪规模的扩大和发展及抗生素的用量增加和滥用，导致细菌耐药性增强，临床出现多重耐药菌株和超级耐药菌株［2-6］。细菌耐药机制的产生主要原因是细菌基因在菌体内外、抗性环境及高浓度抗生素环境的压力下发生变异，使细菌的细胞膜能阻止甚至外排抗菌药物的进入，使其具有了生成生物膜的能力［7-11］。其中，细菌产生灭活酶或修饰酶是耐药菌的重要耐药机制，而β-内酰胺酶是此类酶中数量最多者。到目前为止，细菌产生的β-内酰胺酶已近500种。新德里金属β-内酰胺酶（NDM）在一印度裔瑞典患者的泌尿道肺炎克雷伯菌分离株中检测到，2008年第一次被报道，从此，NDM酶迅速传播并在多个国家的病例中有发现［12-17］。NDM型金属酶可高效水解多种抗生素，携带有该酶的菌株对几乎所有的抗生素均耐药，包括碳青霉烯类和β-内酰胺类在内的多类抗菌药物，所以被称为“超级细菌”［18-22］。NDM基因主要包括NDM-1-NDM-50的几十个亚型，其中动物源大肠杆菌上NDM-1和NDM-5基因的流行率呈递增趋势［23-27］，几乎突破了临床抗感染治疗的最后一道防线［28-32］。因此，研发新型药物、替抗药物或者寻找一种有效的抗生素替代疗法成为摆在全球科研工作者面前的重要科学问题。

本研究从产房仔猪腹泻病例中分离到1株同时产碳青霉烯酶NDM-1和NDM-5的大肠埃希菌，该菌株对临床常用的β-内酰胺类和碳青霉烯类抗生素全部耐药。但是，对磺胺甲恶唑、头孢美唑、大观霉素、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉维酸、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、氨曲南敏感。通过高通量测序和生物信息学分析技术，对HN2106菌株的基因组特征、耐药质粒特征进行了分析，以期为由超级耐药细菌引起的产房仔猪腹泻的防治提供科学参考并为耐药菌的控制及新药研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 本实验室留存（2021年1-12月）从河南省及周边地区猪场产房仔猪腹泻病例中分离鉴定的亚胺培南敏感性减低的87株大肠杆菌，经过PCR检测和测序确定其携带NDM基因，筛选出一株同时携带NDM-1和NDM-5的大肠杆菌，命名为HN2106，以HN2106作为实验菌株，-80℃保存备用。

1.1.2 试剂与器材 美罗培南和亚胺培南购自上海源叶生物科技有限公司；青霉素G、氨苄西林、海他西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢西丁、头孢克洛、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻呋、头孢比肟、头孢喹肟等药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发有限公司，引物合成和分子实验所需试剂购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 耐药基因筛查 根据文献查阅碳青霉烯酶耐药基因［33-34］，基因引物信息见表1。

表1 NDM-5 耐药基因引物序列Table 1 Primer sequence of NDM-5-resistant gene

1.2.2 药敏试验 采用药敏纸片法进行耐药表型测定。判定标准采用中华人民共和国卫生部医政司（纸片法抗菌药物敏感试验标准：WS/T125-1999）。

1.2.3 基因组测序及分析 采用二代+三代即Illumina Hiseq+PacBio的测序方式，对HN2106进行全基因组测序和生物信息学分析。应用BLAST和MEGA软件对序列进行生物信息学分析、系统进化树分析和NDM-1及其亚型鉴定。

2 结果

2.1 大肠埃希氏菌HN2106的药物敏感性

对临床常用的β-内酰胺类抗生素和碳青霉烯类抗生素进行了药物敏感性试验，药敏结果如表2所示。该菌株对临床常用的β-内酰胺类抗生素和碳青霉烯类抗生素全部耐药，对磺胺甲恶唑、头孢美唑、大观霉素、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉维酸、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、氨曲南敏感。

表2 药敏试验结果Table 2 Results of drug susceptibility testing

2.2 大肠埃希氏菌HN2106的基因组特征

Circos基因组圈图可以全面展示基因组的特征，通过Circos软件绘制单个样本基因组圈图（图1）。大肠埃希氏菌HN2106的基因组图包含5 179 971 bp，其G+C含量为50.59%。利用PlasFlow（https：//github.com/smaegol/PlasFlow）软件对细菌基因组组装结果进行质粒的鉴定，获得的质粒序列利用 BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 和PLSDB 数 据 库（https：//ccb-microbe.cs.uni-saarland.de/plsdb/）进行质粒注释。经分析显示，HN2106中含有7个质粒（plasmid A、plasmid B、plasmid C、plasmid D、plasmid E、plasmi D 和 plasmid G），3种类型，分别为Col、IncFII、IncQ1。

图1 HN2106基因组圈图Fig. 1 Genome circle diagram of E. coli HN2106

2.3 pNDM5-HN2106质粒分析

pNDM5-HN2106（plasmid B） 长 度 为 74 815 bp，其G+C含量为50.24%（图2）。通过分析显示，该质粒含有1个耐药基因blaNDM-5，该质粒类型 为 IncQ1。 通 过 将 pNDM5-HN2106（plasmid B）全序列和GenBank数据库进行BLAST比对分析发现，该质粒和最近报道的1个质粒pKP-NDM-5（Accession No CP084746.1）匹配（99.76%的相似性和覆盖率，该质粒来源于肺炎克雷伯菌）。该质粒和另一个质粒NDM1 plasmid unnamed 2（Accession No CP083890.1）也有很高的相似性（99.08%的相似性和覆盖率，该质粒来源于1株大肠埃希氏菌）。为了进一步验证pNDM5-HN21（plasmid B）的基因型，用MEGA软件对35个NDM基因质粒进行系统进化树分型，分型结果显示，与pKP-NDM-5（Accession No CP084746.1）亲缘关系最近，聚入同一分支，为NDM5型。

图2 Plasmid B圈图Fig. 2 Plasmid B circle

2.4 pNDM1-HN2106（plasmid C）质粒分析

pNDM1-HN2106（plasmid C） 长 度 为 35 423 bp，其G+C含量为53.44%（图3）。该质粒含有1个耐药基因blaNDM-1，质粒类型为IncFII。通过将pNDM1-HN2106（plasmid C）全序列和GenBank数据库进行BLAST比对分析发现，该质粒和最近报道的1个质粒p1108-NDM（Accession No MG825381.1）匹配（99.98%的相似性和覆盖率，该质粒来源于1株大肠埃希氏菌）。此外，该质粒和其他一些质粒也有很高的相似性，例如p8C57-NDM（Accession No MT407546.1）、pNDM33-3（AccessionNo CP076650.1）等。为了进一步确定pNDM-HN21（plasmid C）的基因型，用MEGA软件对55个NDM基因质粒进行系统进化树分型，分型结果显示，pNDM-HN2106（Plasmid C）的基因型与p1108-NDM（Accession No MG825381.1，该质粒来源于大肠埃希氏菌，99.98%的相似性和覆盖率）和p8C57-NDM（Accession No MT407546.1，95%的覆盖率和99.98%的序列相似性，该质粒来源于大肠埃希氏菌）亲缘关系最近，聚入同一分支，为NDM1型。

图3 Plasmid C圈图Fig. 3 Plasmid C circle diagram

2.5 大肠埃希氏菌HN2106耐药基因

经综合的抗生素抗性基因数据库（Comprehensive Antibiotic Resistance Database，CARD）分析显示，HN2106含有21种类型的抗生素耐药基因（图4），包括大环内脂类、四环素类、氟喹诺酮类、青霉烷类、头孢菌素类、苯丙醇类、头霉素类、氨基糖苷类、肽类、碳青霉烯类、氨基香豆素类、单胺菌素类、青酶烯类、利福霉素类、甘氨酰环素类、吖啶染料类、糖肽类、林可酰胺类、三氯生类、硝基咪唑类、其他类（截短侧耳素类、链霉杀阳菌素类、核苷类、磺胺类、二氨基嘧啶类、磷霉素类、恶唑烷酮类、硝基呋喃类、莫匹罗星类、砜类、双环霉素类、游离脂肪酸类、氯化苯甲烃铵类、若丹明类）。具体耐药基因见附件1。

图4 21种类型的抗生素耐药基因Fig. 4 21 types of antibiotic resistance genes

3 讨论

随着碳青霉烯类和β-内酰胺类抗生素的广泛应用或不规范应用，使大肠杆菌对碳青霉烯类和β-内酰胺酶抗生素产生了耐药性，尤其是携带NDM基因的大肠杆菌的出现［35-38］。碳青酶烯类耐药肠杆菌（carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE）和多重耐药菌已成为临床防控的严峻挑战［39］。NDM耐药菌对几乎所有的β-内酰胺类药物耐药，对动物疾病治疗、公共卫生和食品安全提出了严峻挑战和造成了极大威胁［40-43］。NDM-1“超级细菌”是指许多种（NDM1-NDM50）拥有新德里金属β-内酰胺酶-1（new delhi-metallo-1，NDM-1）基因的细菌的统称，携带该基因的耐药菌被称为“超级细菌”［44-48］。目前，已检测到产NDM-1基因的主要细菌包括摩氏摩根菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等［49-53］。因此，开展NDM流行病学调查对临床感染的防控和新药物研发具有重要意义。本研究从产房仔猪腹泻病例中分离出1株碳青霉烯酶耐药基因，经16S rRNA基因测序、NDM耐药基因扩增以及基因组测序分析，均表明该菌株为大肠埃希菌。药敏试验显示，该菌株除对碳青霉烯类抗生素亚胺培南耐药外，还对检测的其他类型抗菌药物如β-内酰胺类抗生素耐药，表明该菌株为多重耐药菌。再结合PCR检测及全基因组测序分析，表明该菌株是一株产NDM-5和NDM-1的双重质粒的多重耐药大肠埃希菌。

HN21含有21种类型的抗生素耐药基因。进一步分析发现，blaNDM-5位于质粒pNDM5-HN2106（plasmid B）上，blaNDM-1位于质粒pNDM1-HN2106（plasmid C）上。以上结果表明，NDM耐药基因主要位于质粒上，借助质粒的可传递性，并通过质粒复制、接合、转化及转座子移位，NDM耐药基因便很容易地传播给其他细菌，引起更大范围的暴发流行和更广泛的耐药。

序列比对发现，blaNDM-5携带质粒pNDM5-HN2106（plasmid B）和国内所报道的1个质粒pKPNDM-5（Accession No CP084746.1）在序列上有高度的一致性（99.76%的相似性和覆盖率），该质粒来源于浙江金华医院分离的肺炎克雷伯菌。该质粒和另一个质粒NDM1 plasmid unnamed2（Accession No CP083890.1）也有很高的相似性（99.08%的相似性和覆盖率），该质粒来源于澳大利亚1株大肠埃希氏菌。通过基因进化树分析发现，pNDM5-HN2106（plasmid B）的基因型与pKP-NDM-5（Accession No CP084746.1，99.76%的相似性和覆盖率，该质粒来源于肺炎克雷伯菌）亲缘关系最近，聚入同一分支。因此，确定pNDM5-HN2106（plasmid B）为NDM5型。以上研究表明，pNDM5-HN2106（plasmid B）类似质粒具有世界流行性的特点，同时该类型质粒对blaNDM-5耐药基因的传播发挥着重要作用。该质粒可在不同种属之间传播，分离自不同的细菌，包括肺炎克雷伯菌和大肠杆菌。表明该类型质粒可以跨越种属限制而自由传播，同时还发现这种类型质粒可以分离自不同的样本，包括人和动物，进一步说明了该类型质粒传播的广泛性。

pNDM-1-HN2106（plasmid C）是本研究发现的另外一个含有NDM基因的质粒，通过序列比对和分析发现，blaNDM-1携带质粒pNDM1-HN2106（plasmid C） 和 国 内 报 道 的 p1108-NDM，（Accession No MG825381.1，99.98%的相似性和覆盖率，该质粒来源于1株从食品中分离到的大肠埃希氏菌）、p8C57-NDM（Accession No MT407546.1，95%的覆盖率和99.98%的序列相似性，该质粒来源于大肠埃希氏菌）匹配。为了进一步确定pNDM1-HN2106（plasmid C）的基因型，对55个NDM基因进行系统进化树分型，确定pNDM1-HN2106（plasmid C）的基因型为NDM-1型。以上研究表明，pNDM1-HN2106（Plasmid C）质粒可以在食品和动物之间相互传播，这已说明了食品、动物和人相互传播的广泛性。

本研究鉴定的HN2106为多重耐药大肠埃希菌，经全基因组测序，HN21中含有7个质粒（plasmid A、plasmid B、plasmid C、plasmid D、plasmid E、plasmid F和plasmid G），Col、IncFII、IncQ1三种类型。主要携带两种耐药质粒pNDM5-HN2106（plasmid B）和pNDM1-HN2106（plasmid C），分别介导blaNDM-5和blaNDM-1耐药基因，为耐药菌进行传播和扩散形成了基础。blaNDM-1耐药基因的共存与传播给动物和人类及食品安全造成隐患和威胁，有必要加大对动物领域的流行病学调查，为临床防控提供参考。该研究为此类菌株的潜在传播机制提供了依据，说明了临床用药的合理以及对此类菌株进行监控的重要性。

4 结论

通过对HN2106菌株碳青霉烯酶NDM-1和NDM-5的耐药基因扩增、测序及全基因组测序分析，证实了HN2106菌株携带NDM-1和NDM-5的耐药基因，其中blaNDM-1位于质粒pNDM-HN2106（Plasmid C）上，blaNDM-5位于质粒pNDM5-HN2106（Plasmid B）上，分别介导blaNDM-1和blaNDM-5耐药基因，是耐药菌传播的重要载体。全基因组耐药基因预测结果显示其同时还携带21种类型的抗生素耐药基因。

文章附件请到本刊官网下载（http：//biotech.aiijournal.com/CN/1002-5464/home.shtml）。