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槲皮素对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞增殖与凋亡的影响研究

2022-11-01江雪娟陈晓菲俞佳王晨晔胡慧敏丁彩飞

浙江中医药大学学报 2022年10期
关键词:颗粒细胞槲皮素试剂盒

江雪娟 陈晓菲 俞佳 王晨晔 胡慧敏 丁彩飞

浙江省中西医结合医院 杭州 310005

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是育龄女性常见的生殖内分泌及代谢疾病,临床多表现为排卵障碍、肥胖、胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)、脂代谢异常等[1]。IR是上述疾病的中心环节,IR导致的高胰岛素血症增加了患者罹患2型糖尿病、肥胖以及心血管疾病的风险[2]。目前,PCOS的发病原因及机制尚未完全阐明,给临床诊断和治疗带来较大阻碍。

槲皮素(quercetin,Q)生物学活性较高且药理作用广泛,具有降糖、降脂、抗氧化损伤等作用[3]。晚期糖基化终末产物/晚期糖基化终末产物受体(advanced glycation end products/receptor of advanced glycation end products,AGEs/RAGE)信号通路是体内糖代谢信号通路之一,不仅与IR密切相关,同时也对细胞的生长、凋亡具有显著的调控作用。既往研究提出,槲皮素可以改善PCOS大鼠氧化应激状态[4],但具体机制尚需进一步验证。因此本研究以此作为切入点,探究槲皮素是否通过调控AGEs/RAGE 信号通路改善PCOS大鼠IR和排卵障碍,明确其治疗PCOS的分子机制,对今后研究PCOS伴IR提供一种新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验试剂 四甲基偶氮唑盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]试剂盒购于上海BBI Life Sciences公司(批号:E606334-0500);大鼠孕激素/孕酮(proges terone/progesterone,PROG)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒、大鼠雌二醇(estradiol,E2)ELISA试剂盒均购于江苏酶免实业有限公司(批号:MM-0551R2、MM-0575R2);大鼠黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、雄激素(testosterone,T)ELISA试剂盒均购于上海酶联生物科技有限公司(批号:ml002860、ml059506);细胞凋亡检测试剂盒购于美国BD公司(批号:556547);活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司(批号:S0033S);逆转录试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司(批号:CW2569);AGEs多克隆抗体购于北京Bioss公司(批号:BS-1158R);RAGE、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular singnal regulated protein kinases,ERK1/2)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(phospho-extracellular singnal regulated protein kinases 1/2,phospho-ERK1/2)、p38有丝分裂原蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)、磷酸化p38有丝分裂原蛋白激酶(p38 phospho-mitogen-activated protein kinase,phospho-p38 MAPK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体均购于江苏Affinity公司(批号:AF5309、AF0155、AF1015、BF8015、AF4001、AF7021)。

1.2 实验仪器 TS-2倒置荧光显微镜购于日本尼康公司;C6流式细胞仪购于美国BD公司;CFX Connect实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR)仪为BIO RAD公司产品。

1.3 实验动物 无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级雌性SD大鼠30只,购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2017-0005],21~23 d龄,体质量(60±10)g,饲养于杭州鹰旸生物科技有限公司动物中心[实验动物使用许可证号:SYXK(浙)2020-0024],本研究动物伦理已获得杭州鹰旸生物科技有限公司动物中心许可(伦理批准号:EYOUNG-20201230-03)。

1.4 伴IR的PCOS大鼠模型的建立 随机选择10只大鼠作为正常对照组,20只作为模型组。大鼠饲喂普通饲料1周后,PCOS模型组每日饲喂高脂饲料并以1%羧甲基纤维素(carboxyl methyl cellulose,CMC)溶解的来曲唑液0.4 mL灌胃,剂量1 mg/(kg·d),对照组灌胃同体积1%CMC,连续灌胃23 d,模型建立参照Sun等[5]的研究。自23 d起进行阴道涂片观察,以阴道涂片提示失去完整动情周期作为PCOS大鼠建模成功的标志。

1.5 方法

1.5.1 卵巢颗粒细胞的提取、培养及鉴定 PCOS模型大鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG),50 U/只,2 d 后脱颈处死。紫外照射后分离双侧卵巢,于灭菌0.9%氯化钠溶液中保存。剔除卵巢表面包膜及脂肪组织,再次以0.9%氯化钠溶液进行清洗,最后放入达尔伯克改良伊格尔培养基/F12(Dulbecco's Modified Eagle Media/F12,DMEM/F12)中。利用空针针头刺破卵泡,将释放的细胞置于培养基中,并用巴氏管吹打,过筛。收集细胞悬液,取20 mL单细胞悬液进行细胞计数,调整细胞浓度为2×106/mL,加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养。光镜观察,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色鉴定,观察卵巢颗粒细胞的形态及核质分布。

1.5.2 实验分组及药物干预 细胞培养2 d后,将来自PCOS大鼠的颗粒细胞随机分成6组,PCOS组、PCOS+4-氯-N-环己基-N-(苯基甲基)苯甲酰胺[(N-benzyl-4-chloro-N-cyclohexylbenzamide,FZ)500 nmol·L-1]组、PCOS+L-Q(槲皮素低剂量0.5 μg·mL-1)组、PCOS+H-Q(槲皮素高剂量1 μg·mL-1)组、PCOS+H-Q+FZ(槲皮素高剂量1 μg·mL-1+FZ 500 nmol·L-1)组、PCOS+二甲双胍(metformin hydrochloride,MH)组,MH用药剂量参考Huang等[6]的实验研究,另取正常大鼠的颗粒细胞作为对照组。阻断剂组以FZ预处理30 min,各组培养2 d后进行相关检测。

1.5.3 MTT检测细胞活力

1.5.3.1 MTT检测槲皮素对正常颗粒细胞活力的影响 细胞经过胰酶消化后,按每孔2×103个的数量接种于96孔板,每孔200 mL,设置5个复孔。给予不同浓度槲皮素(0、0.01、0.1、1、10 μg·mL-1)处理24、48 h,利用MTT法测定细胞活力。

1.5.3.2 MTT检测不同药物处理对PCOS颗粒细胞活力的影响 细胞经胰酶消化后,按每孔2×103个的数量接种于96孔板,每孔200 mL,设置5个复孔。各组别参照1.5.2中给药剂量并设对照组处理24、48 h,利用MTT法测定细胞活力。

1.5.4 ELISA检测激素含量 按照ELISA试剂盒操作说明,测定细胞上清液中E2、P、FSH、LH和T的含量。

1.5.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将细胞以每孔1.2×106个的数量接种于6孔板中,按照分组给药处理24 h后,调整细胞浓度为1×106个/mL。依次加入500 μL结合缓冲液,弃去上清液,再次加入100 μL结合缓冲液后混匀,分别加入异硫氰酸荧光素标记磷脂结合蛋白(Annexin-fluorescein isothiocyanate isomer,AnnexinⅤ-FITC)5 μL与碘化丙啶(propidium iodide,PI)10 μL,避光孵育后再次加入400 μL结合缓冲液,上机检测细胞凋亡。

1.5.6 ROS活性检测 取对数生长期细胞,消化后制成1×105/mL细胞悬液,加入24孔板中,然后加入2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯50 μL,37 ℃下避光孵育20 min,洗涤后倒置显微镜观察并拍摄图像。

1.5.7 Real-time qPCR检测RAGE、Bax、Bcl-2及炎性介质HMGB1的mRNA表达 收集细胞,提取RNA,配置反应体系进行逆转录及Real-time qPCR反应,检测RAGE、Bax、Bcl-2及炎性介质HMGB1的mRNA表达。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5.8 免疫印迹法检测AGEs、RAGE、MAPK、ERK蛋白水平 收集细胞,裂解后提取总蛋白,电泳和转膜后,加入一抗、二抗孵育,化学发光显影,检测AGEs、RAGE、MAPK、ERK蛋白水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析,计量资料以表示,不同组间两两比较采用单因素方差分析,同组间采用SNK分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢颗粒细胞的鉴定结果 光镜下大鼠卵巢颗粒细胞生长旺盛,形态多呈梭形或多边形。HE染色显示,贴壁细胞边缘清晰、形态完整,核染成蓝紫色,胞质为淡粉色。见图1。

图1 卵巢颗粒细胞的鉴定结果Fig.1 Identification results of ovarian granulosa cells

2.2 各组细胞活力比较 对于正常大鼠颗粒细胞,给予不同浓度的槲皮素处理后,仅10 μg·mL-1组细胞活性显著降低(P<0.05,P<0.01),低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。而在PCOS大鼠颗粒细胞中,与对照组比较,PCOS组细胞活性显著降低(P<0.01)。与PCOS组比较,药物作用24 h后,PCOS+H-Q+FZ组和PCOS+MH组细胞活性显著升高(P<0.01);药物作用48 h后,PCOS+FZ组、PCOS+H-Q组、PCOS+H-Q+FZ组和PCOS+MH组细胞活性均显著升高(P<0.05,P<0.01)。见图2。

图2 各组细胞活力比较Fig.2 Comparison of cell viability in each group

2.3 各组细胞中激素含量比较 与PCOS组比较,PCOS+FZ 组、PCOS+H-Q 组、PCOS+H-Q+FZ 组 和PCOS+MH组细胞中E2、LH、T的含量均显著降低(P<0.05,P<0.01)。见表2。

表2 各组细胞E2、P、FSH、LH、T含量比较Tab.2 Comparison of contents of E2,P,FSH,LH and T in each group()

表2 各组细胞E2、P、FSH、LH、T含量比较Tab.2 Comparison of contents of E2,P,FSH,LH and T in each group()

注:与PCOS组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01。Note: Compared with PCOS group,▲P<0.05,▲▲P<0.01.

2.4 各组细胞凋亡情况比较 与PCOS 组比较,PCOS+FZ 组、PCOS+H-Q 组、PCOS+H-Q+FZ 组 和PCOS+MH组卵巢颗粒细胞凋亡率均显著降低(P<0.05,P<0.01)。见图3。

图3 各组细胞凋亡情况比较Fig.3 Comparison of cell apoptosis in each group

2.5 各组卵巢颗粒细胞中ROS活性比较 与PCOS组比较,PCOS+FZ组、PCOS+H-Q组、PCOS+H-Q+FZ组和PCOS+MH组卵巢颗粒细胞中ROS的荧光强度显著减弱(P<0.05,P<0.01),说明细胞中ROS活性显著降低。见图4。

图4 各组卵巢颗粒细胞中ROS荧光表达情况Fig.4 ROS fluorescence expression in ovarian granulosa cells of each group

2.6 各组细胞RAGE、Bax、Bcl-2及HMGB1的mRNA表达比较 与PCOS组比较,PCOS+H-Q组、PCOS+H-Q+FZ 组、PCOS+MH 组中RAGE、HMGB1 及Bax mRNA 表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),Bcl-2 mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。见图5。

图5 各组细胞RAGE、Bax、Bcl-2及HMGB1的mRNA表达比较Fig.5 Comparison of mRNA expression of RAGE,Bax,Bcl-2 and HMGB1 in each group

2.7 各组细胞AGEs/RAGE及ERK/MAPK信号通路相关蛋白表达比较 与PCOS 组比较,PCOS+FZ 组、PCOS+H-Q、PCOS+H-Q+FZ组和PCOS+MH组AGEs和RAGE 蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),PCOS+H-Q组、PCOS+H-Q+FZ组和PCOS+MH组中的p-ERK和p-p38MAPK 蛋白表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01)。见图6。

图6 各组细胞AGEs、RAGE、p-ERK、ERK、p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表达比较Fig.6 Comparison of protein expressions of AGEs,RAGE,p-ERK,ERK,p-p38MAPK and p38MAPK in each group

3 讨论

PCOS属于生殖障碍与代谢紊乱并存的疾病,临床治疗虽然可使患者获得一定质量的卵母细胞,但是却无法获得较多高质量的成熟卵母细胞[7-8],因此积极深入探究其发病机制是如今PCOS研究的关键问题。本研究首先通过MTT法检测细胞活力,以确定槲皮素的合适干预浓度。以连续灌胃来曲唑并配合高脂饲料的方式,建立PCOS大鼠模型,并将阴道涂片失去完整动情周期作为模型制备成功的标准。T增高作为本病的典型内分泌改变,与月经稀发、无排卵、不孕等密切相关。本研究提示,槲皮素干预后性激素水平也得到改善,提示槲皮素在改变PCOS大鼠异常性激素水平方面有较好的潜能,并且高剂量组改善效果更为明显。Jahan等[9]研究发现,槲皮素处理22 d后,PCOS大鼠卵巢直径以及囊性卵泡的直径均显著减小,并且T、LH含量降低,与本文结论一致。

RAGE是一种具有重要功能的细胞表面受体,当其与配体AGEs结合后,能够引起下游多条信号通路的改变,引起一系列生物学反应,加快机体细胞的凋亡[10]。FZ是一种近期发现的AGEs/RAGE通路小分子阻断剂,在多项研究中已有运用。本研究运用槲皮素及AGEs/RAGE通路阻断剂对PCOS大鼠的卵巢颗粒细胞进行干预,从而能够更明确地探究槲皮素对AGEs/RAGE通路的作用机制。在阳性药物选择上,针对IR,将临床应用最广泛的二甲双胍列入实验分组中[11],从而能够更好地评价槲皮素的作用。细胞凋亡实验观察到PCOS组细胞凋亡率最高,而加入阻断剂及高剂量槲皮素处理后,细胞凋亡率显著减低,与PCOS+MH组结果趋同,并且其中仅加入阻断剂和仅进行高剂量药物处理组均能够显著降低细胞凋亡,可以推测槲皮素可能发挥与阻断剂相同的作用,阻断AGEs/RAGE通路活性,从而保护细胞。

HMGB1是一种新发现的炎症因子,可介导IR,从而诱导卵巢颗粒细胞的凋亡[12]。与细胞凋亡关系最密切的当属Bcl-2家族,其中以Bcl-2和Bax最具典型。Bcl-2是一种癌基因,能够作为潜在的抑制因子调节细胞凋亡;而Bax与之相反,是一种凋亡促进因子[13]。本研究中,槲皮素高剂量组及阻断剂加高剂量组HMGB1及Bax的mRNA表达水平显著降低,Bcl-2的mRNA表达水平显著升高,推测槲皮素可抑制细胞凋亡。另外,加入阻断剂及槲皮素处理均可见卵巢颗粒细胞中ROS的荧光强度显著减弱,提示ROS活性降低。申超[10]在研究中指出,ROS是激活促炎反应的重要上游介质,因此可推断槲皮素或许可以降低机体的炎症反应,起到细胞保护作用,这一作用有待后续实验进一步验证。

MAPK属于丝氨酸蛋白激酶,在磷酸化过程中可促进其他胞质蛋白磷酸化,ERK是MAPK家族成员,能够在细胞增殖、分化过程中发挥重要的调控作用[14]。ERK表达量升高时会导致胰岛素信号传导通路受到破坏,从而增强IR,因此降低EPK表达,升高p-ERK表达将能够减轻细胞损伤。研究指出,p38MAPK与IR的形成密切相关,p-p38 MAPK含量与细胞的增殖密切相关,但有关p-p38 MAPK、p-ERK与AGEs/RAGE通路的研究却较少见于报道[15-16]。本研究发现,加入槲皮素及通路阻断剂后,AGEs和RAGE的蛋白表达水平显著降低,表明AGEs/RAGE通路活性受到抑制;而p-ERK和p-p38 MAPK的蛋白的表达水平均显著升高,提示AGEs/RAGE通路活性受到抑制时,细胞增殖调控因子含量升高,从而起到细胞保护作用。

综上所述,本研究发现槲皮素能够抑制PCOS模型大鼠中卵巢颗粒细胞凋亡,促进细胞增殖,其作用主要是通过抑制AGEs/RAGE通路活性实现的。

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