贝莱斯芽孢杆菌发酵液对樱桃番茄贮藏品质的影响

赵焕兰，曹嘉灿，刘奎，范叶珍，苗敏

（合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥 230601）

樱桃番茄又称圣女果、小番茄，果实营养丰富，酸甜适口，是一种广受欢迎的果蔬；因其具有多汁、皮薄、组织柔软等特性采后易受到机械损伤，而损伤后的果实极易遭受微生物侵染，使其在贮藏期间容易发生腐烂变质[1-3]。同时贮藏期间易出现失水现象，造成表皮皱缩，使得口感和品相欠佳，降低其食用价值和商品价值[4-5]，因此寻找安全有效的保鲜方式延长樱桃番茄的贮藏期具有重要意义。目前对包括樱桃番茄在内的果蔬保鲜措施已有广泛的研究，主要措施包括化学方法（化学防腐剂）[2，6]、物理方法（低温冷藏，热处理，辐射）[7-9]、生物方法（植物抑菌物，拮抗微生物）[10-13]。

随着人们对绿色环保和食品安全的不断追求，安全无害的生物保鲜技术成为研究热点。在生物保鲜技术中，拮抗微生物因分布广泛、获取容易、培养经济等优点一直广受关注。然而实际应用过程中直接将拮抗微生物作为保鲜剂具有一定的局限性，若受到污染或是接触不良环境都会使保鲜效果大打折扣，发酵液即拮抗微生物（生防菌）在适宜培养基内生长后滤除菌体的培养液，其含有大量的活性代谢产物，因此将发酵液作为保鲜剂是更佳的保鲜措施[14-15]。生防菌发酵液在众多领域发挥着重要作用，尤其是在果蔬采后保鲜方面。而细菌是目前研究最普遍，应用最广的一类拮抗微生物，常见的有假单胞菌和芽孢杆菌，其中新型生防菌贝莱斯芽孢杆菌在近几年引起了人们广泛地研究，文献[16]发现一株贝莱斯芽孢杆菌发酵液对樱桃番茄的自然腐败有抑制作用，并且能延缓质量损失，但对于保鲜指标测量相对较少。

本研究前期分离鉴定得到一株贝莱斯芽孢杆菌，命名为A4。在此基础上以A4发酵液为研究对象，探究其对樱桃番茄贮藏品质的影响。选取腐烂率及失重率，物性（硬度、脆性、紧实度），可溶性固形物、可滴定酸、类黄酮、番茄红素及酚类物质含量为评价指标，以更全面地评判番茄品质变化及A4发酵液的保鲜效果，最后初步探究发酵液作用的保鲜机理。本研究为贝莱斯芽孢杆菌的应用提供理论基础，为樱桃番茄采后贮藏保鲜提供新技术思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）A4：合肥工业大学食品与生物工程学院生物实验室前期分离鉴定并保存。樱桃番茄：市售，果实新鲜无伤，大小均匀一致。

胰蛋白胨、酵母提取物：BioFroxx公司；NaCl、NaOH、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、硼酸、没食子酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）试剂盒、过氧化物酶（peroxidase，POD）试剂盒：南京建成科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ZWY-1102双层大容量恒温摇床：中国合肥启诚生物科技有限公司；mls-3750高压蒸汽灭菌锅：日本三洋公司；ST8R低温高速大离心机：赛默飞世尔科技公司；PK-S22恒温水浴锅：中国上海精宏实验设备有限公司；Multiskan GO全波长酶标仪：北京龙跃生物科技发展有限公司；TA.XTplus物性测试仪：英国Stable公司。

1.3 方法

1.3.1 A4除臭发酵液的制备

参考文献[17]的方法配制除臭发酵培养基（10 g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl、葡萄糖20g/L，ddH2O定容至1 L，121℃灭菌20 min）。菌种活化后培养至浓度在600nm下的吸光度为0.6（OD600nm=0.6），转接于除臭发酵培养基，接种量为0.5%，37℃、180 r/min的摇床上振荡培养48 h，真空泵抽滤去除菌体，所得发酵液保存于4℃备用。

1.3.2 樱桃番茄保鲜试验处理

参考文献[18]对樱桃番茄进行处理：将樱桃番茄分为两组，每组4kg，一组浸泡于10%的A4发酵液中（FJY），另一组浸泡于10%的LB培养基（10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，ddH2O 定容至 1 L，121℃灭菌20 min）中作为对照（CK）。10 min后取出自然晾干，装入保鲜盒，25℃，80%～90%相对湿度条件下贮藏。1.3.3 腐烂率及失重率的测定

参考文献[19]方法，每2 d测量每组樱桃番茄总质量，同时观察并记录番茄腐烂个数，试验重复2次。腐烂率和失重率计算公式如下。

1.3.4 硬度、脆性、紧实度的测定

处理方法同1.3.2，间隔2 d各组随机选取5个樱桃番茄样品，果实赤道处选取2个位置作为测量点，使用质构仪测量樱桃番茄的硬度、脆性和紧实度，试验重复3次。

1.3.5 可溶性固形物及可滴定酸的测定

1.3.4 中测质构后的樱桃番茄样品用于可溶性固形物及可滴定酸的测定，使用数显糖度仪测量其汁液的可溶性固形物含量。取适当果肉组织，用液氮冷冻后研磨至细粉状，于-80℃保存备用。

参考文献[20]的酸碱滴定法测定并计算可滴定酸含量，使用0.01 mol/L NaOH溶液进行滴定。

1.3.6 类黄酮、番茄红素及总酚的测定

参考文献[21]的方法测定类黄酮的含量，在波长510 nm处测定吸光度，并用芦丁做标准曲线计算类黄酮含量。

参考文献[22]的方法测定番茄红素的含量，称取0.40 g组织粉末，加入4 mL提取液（正己烷∶丙酮∶乙醇的体积比为 2∶1∶1），充分溶解后于冰浴静置 10 min，取上清液检测，以正己烷为空白，在波长472 nm处测定吸光度，并计算番茄红素含量。

参考文献[21]的方法的测定总酚的含量，在波长735 nm处测定吸光度值，并用没食子酸做标准曲线计算总酚含量。

1.3.7 抗性酶活力及丙二醛（malondialdehyde，MDA）浓度的测定

总SOD活力测定：根据总超氧化物歧化酶试剂盒说明书配制溶液，参考操作表添加相关试剂，混匀后，室温放置10 min，使用酶标仪于波长550 nm处测定吸光度。

POD活力测定：根据过氧化物酶（POD）试剂盒说明书进行操作，准确称取果肉组织0.10 g，加入900 μL浓度为0.05 mol/L pH7磷酸盐缓冲液，冰水浴条件下制备成10%的组织匀浆液，3 500 r/min离心10 min后，取上清液进行POD活力的测定。参考操作表添加相关试剂，混匀后，3 500 r/min离心10 min，使用酶标仪于420 nm处测定吸光度。

参考文献[23]的方法测定苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）的活力，制备粗酶提取液及硼酸缓冲液，取50 μL的粗酶液，加入150 μL pH8.8的硼酸缓冲液，在波长290 nm处测定起始吸光度及在37℃恒温箱中放置1 h后的吸光度。

参考文献[24]测定MDA浓度，采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法测定丙二醛（MDA）的浓度。分别检测在450、532、600 nm 3处波长的吸光度，即可计算出MDA的浓度。

1.4 数据处理

采用SPSS statistics 23.0软件进行数据的统计分析，差异显著性采用邓肯氏多重比较法，Origin9.0软件绘图。

2 结果分析

2.1 腐烂率及失重率

A4发酵液樱桃番茄贮藏期间腐烂率和失重率的影响如图1所示。

图1 A4发酵液对樱桃番茄贮藏期间腐烂率和失重率的影响Fig.1 Effects of Bacillus velezensis A4 fermentation supernatant on decay rate and weight loss rate of cherry tomato during storage

由图1A可知，相同贮藏时间内发酵液处理组的腐烂果实数量显著少于对照组，第12天数据统计显示，对照组的腐烂率已高达27.97%，而发酵液处理组的腐烂率仅为6.38%，显著低于对照组。由图1B可知，贮藏30 d后对照组果实已接近全部腐烂变质，而处理组仍有相当数量果实处于形态色泽较好的健康状态。表明贝莱斯芽孢杆菌A4的发酵液具有显著抑制樱桃番茄腐烂的作用。

由图1C可知，樱桃番茄的失重率随贮藏时间的延长而逐渐增加，在整个贮藏期间对照组的失重率均显著高于处理组。这一趋势表明A4发酵液能有效降低水分的蒸发，较好地保持果实质量。

2.2 硬度、脆性及紧实度

A4发酵液对番茄贮藏期间各物性指标的影响如图2所示。

图2 A4发酵液对番茄贮藏期间各物性指标的影响Fig.2 Effects of Bacillus velezensis A4 fermentation supernatant on physical properties of cherry tomato during storage

由图2A、图2B可知，樱桃番茄贮藏期间果实硬度和脆性均随贮藏时间的延长而逐渐降低，贮藏初期（0～2 d），对照组与处理组的硬度及脆性并无明显差异，但随着贮藏时间延长，樱桃番茄果实的硬度及脆性经A4发酵液处理后降低缓慢，得到较好的保持；同时A4发酵液对果实紧实度的维持效果显著，随贮藏时间延长，发酵液处理组果实的紧实度都显著高于对照组果实（图2C）。以上结果表明，A4发酵液可以抑制樱桃番茄物性指标的降低，维持较好的感官属性。

2.3 可溶性固形物及可滴定酸

发酵液对樱桃番茄贮藏期间可溶性固形物和可滴定酸含量的影响如图3所示。

图3 A4发酵液对樱桃番茄贮藏期间可溶性固形物、可滴定酸含量的影响Fig.3 Effects of Bacillus velezensis A4 fermentation supernatant on the content of soluble solids and titratable acids in cherry tomato during storage

由图3A可知，樱桃番茄贮藏期间果实可溶性固形物含量随贮藏时间的延长而逐渐降低，而经A4发酵液处理的樱桃番茄果实的可溶性固形物含量降低缓慢，尤其在贮藏期的8 d～12 d，果实的可溶性固形物含量得到较好的保持；果实中可滴定酸含量显示出同样的变化趋势，在贮藏初期发酵液对可滴定酸的保持作用有限，但随着贮藏时间延长，发酵液具有延缓可滴定酸损失的效果（图3B）。上述结果表明A4发酵液能抑制樱桃番茄可溶性固形物和可滴定酸的含量降低。

2.4 类黄酮、番茄红素及总酚

由于短期贮藏条件下樱桃番茄中类黄酮、番茄红素、总酚的含量变化不大，进而延长贮藏时间，测定第6天和第12天上述3项指标的变化。A4发酵液对樱桃番茄贮藏期间类黄酮、番茄红素及总酚含量的影响如图4所示。

图4 A4发酵液对樱桃番茄贮藏期间类黄酮、番茄红素及总酚含量的影响Fig.4 Effects of Bacillus velezensis A4 fermentation supernatant on the content of flavonoids,lycopene,and total phenols in cherry tomato during storage

由图4可知，贮藏期间发酵液处理组中樱桃番茄的类黄酮、番茄红素和总酚含量均显著高于对照组，其中发酵液对总酚含量的保持最为突出。以上结果表明A4发酵液能较好地保持樱桃番茄中类黄酮、番茄红素、总酚的含量。

2.5 抗性酶活力及丙二醛MDA浓度

抗性酶活力及MDA浓度变化如图5所示。

由图5可知，发酵液处理樱桃番茄第6天和第12天，果实3种抗性酶活力随时间的延长而逐渐增加。与对照相比，处理组中总SOD活力虽有增加，但差异较小。而POD活力及PAL活力显著增加，与对照相比，发酵液处理樱桃番茄第12天，POD活力增加了20%，PAL活力增加了32%。樱桃番茄储藏期间，果实的MDA浓度随贮藏时间的延长而逐渐增加，经A4发酵液处理后，MDA浓度增加缓慢。以上结果表明，A4发酵液可以增加樱桃番茄3个抗性酶的活力同时延缓MDA浓度的增加。

3 讨论与结论

本研究为全面评价樱桃番茄品质的变化，选取了3个方面的指标，一方面为综合性评价指标（腐烂率和失重率），在采后的运输贮藏等过程中，因呼吸作用、蒸腾作用以及病原微生物侵染等因素的影响，使得樱桃番茄极易出现失水腐烂等现象，所以失重率和腐烂率能综合地反映樱桃番茄品质的变化。第二方面是包括硬度、脆性和紧实度在内的物性指标，物性指标是衡量果实本身特性和贮藏过程中果实品质好坏的重要指标，如果实抗压力愈强，果实的硬度就愈大也越耐贮藏。第三方面是风味与营养指标，包括可溶性固形物、可滴定酸的质量分数以及类黄酮、番茄红素及酚类物质的含量，其中可溶性固形物通常包括可溶性糖及果胶营养成分，同时也会一定程度上影响番茄口感，因此可以反应番茄的营养和风味变化；而可滴定酸是番茄酸味的主要来源，是番茄重要的风味指标；类黄酮、番茄红素及酚类物质均是重要的抗氧化物质，是番茄贮藏后重要的营养指标。

结果表明贝莱斯芽孢杆菌A4发酵液能显著降低樱桃番茄在贮藏期间的腐烂率和失重率、延缓硬度、脆性、紧实度3个物性指标的降低、同时较好地维持了可滴定酸、可溶性固形物、类黄酮、番茄红素、酚类物质的含量，保持了番茄的风味与营养品质。进一步探究发现，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）3种抗性酶的活性在整个贮藏期内均高于对照组，而处理组丙二醛（MDA）的浓度上升缓慢，对照组迅速升高。这说明预先用发酵液处理的果实在逆境胁迫条件下，防御系统会提高，参与果实防御相关的酶（SOD、POD、PAL）共同作用，降低 MDA的积累，减少对果实的伤害，从而提高果实抗病性，更好地保持樱桃番茄的贮藏品质。

本研究为发酵液作为生防制剂的应用提供了理论基础，也为果蔬保鲜提供了新的技术思路。基于本研究在后续的试验中可以进一步分析鉴定贝莱斯芽孢杆菌A4发酵液中发挥主要抑菌作用的有效成分，探究其抑菌机理并基于此尝试浓缩、添加适当化合物等方法改善发酵液成分，提高保鲜效果，为生产应用提供理论基础和技术支撑。