超高效液相色谱-串联质谱法同时测定水果中9种真菌毒素

倪 杨，杨军军，石 磊，张莹莹，熊 融,

（1.北京市农林科学院林业果树研究所，北京 100093；2.北京市落叶果树工程技术研究中心，北京 100093；3.农业农村部果品及苗木质量监督检验测试中心（北京），北京 100093）

水果是我国居民餐桌上的重要组成部分，其在整个生长周期以及采后加工、贮运销售过程中，尤其在反季节销售模式下的贮藏期间，易受真菌侵染而产生并积累具有毒性的次级代谢产物。目前，主要污染水果的真菌毒素有链格孢菌毒素（toxins，Ts）、展青霉素（Patuline，PAT）、赭曲霉毒素 A（Ochratoxine A，OTA）、橘青霉素（Citrinine，CIT）等，大多具有细胞毒性、胚胎毒性、致畸性、致癌性等多种毒性，可在人体内富集，给人类健康造成极大危害。此外，一直以来，人们在鲜食果品中存在一定的误区，认为去除水果腐烂变质部位即可保证食用的安全性，但研究证明，周围看似健康的部位同样会受真菌侵染并产生毒素，如链格孢菌可使水果内部变质而外观无明显变化，且不能通过冲洗等方式去除毒素；OTA化学结构稳定，即使在高温高压条件下也难以完全分解；PAT是青霉属、曲霉属等60余种真菌的次级代谢产物，这些真菌广泛污染果蔬、粮油及发酵食品，且在冷藏条件下、加工过程中稳定存在，致使毒素污染的范围难以控制，危害难以防控。

鉴于真菌毒素的危害，很多国家和机构都制定了相应的限量标准和分析检测方法，我国在GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中明确规定，PAT在以苹果、山楂为原料的制品和饮料类食品中限量值为50 μg/kg。GB 5009.185-2016《食品安全国家标准 食品中展青霉素的测定》分别以液相色谱-串联质谱法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测苹果、山楂及其制品中的PAT含量，使用LC-MS/MS法，不同试样采用不同前处理方法的检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）分别为 1.5～6 μg/kg、5～20 μg/kg；使用 HPLC法液体试样的 LOD为 6 μg/kg、LOQ为 20 μg/kg，固体、半流体试样的 LOD 为 12 μg/kg、LOQ 为 40 μg/kg。此外，SN/T 4259-2015《出口水果蔬菜中链格孢菌毒素的测定》使用LC-MS/MS同时检测4种Ts，适用于苹果、梨、葡萄、猕猴桃、柑桔等样品，方法的测定低限均为10 μg/kg。

在对真菌毒素检测技术的探索中，基于抗体的免疫化学方法已发展得较为完善，准确的快速定性检测体系已基本建成。而在精准定量检测方面，超高效液相色谱法（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）、HPLC等作为主流色谱技术的代表，尤其与质谱联用，凭借强大的分离能力和较好的灵敏度、准确性，已经发展成为真菌毒素检测领域最为可靠的定性定量分析方法。然而，上述方法前处理操作繁琐，难以满足大批量样品的快速检测，QuECh-ERS作为一项新兴的高效提取净化方法，因其操作简单、适用性广、提取净化效率高等优点，近年来也应用于水果中真菌毒素的检测。曾有研究使用QuEChERS方法结合UPLC-MS/MS或HPLC-MS/MS 分别对红枣、苹果、葡萄、柑橘、芒果中的Ts进行检测，其中，苹果中5种Ts的LOQs为0.02～1.0 μg/kg，其余水果中多种Ts的LODs为0.11～12.4 μg/kg。张晓男等对QuEChERS进行改进，采用新型除水剂4A型分子筛，建立了UPLC-MS/MS同时检测苹果及其制品中Ts、PAT、OTA共7种毒素的定量分析方法，各毒素LODs和LOQs分别为 0.02～1.80 μg/kg、1～5 μg/kg。

前期主要针对单一水果中多种Ts开展检测方法的研究，由于水果在生长发育、采收加工、贮运销售过程中，受多种毒素复合污染的潜在风险较大。因此，本研究综合利用 QuEChERS方法和 UPLCMS/MS技术的优势，对提取溶剂、净化方式及色谱质谱条件进行优化，建立适用于多种水果中多种真菌毒素的检测分析方法，快速富集和净化水果中9种真菌毒素，在保证较高回收率的情况下，简化前处理步骤，相比已有方法具有检出限低、分析时间短、适用范围广等优势，实现水果中多种真菌毒素的快速定性定量检测，以期为监测、评估水果中多组分真菌毒素的污染风险和确证检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

9种真菌毒素标准溶液及其浓度见表1 北京曼哈格生物科技有限公司；甲酸、乙腈 色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司；乙酸、柠檬酸、乙酸铵 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；无水硫酸镁、氯化钠 分析纯，现代东方（北京）科技发展有限公司；超纯水 电阻率大于18.2 MΩ·cm，Milli-Q超纯水机制备；微孔过滤膜 尼龙13 mm×0.22 μm，迪马科技有限公司；ACQUITY UPLC BEH C色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）美国Waters公司；十八烷基硅烷键合硅胶（C，60 μm）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（primary secondary amine，PSA，60 μm） 日本岛津公司；桃、樱桃、苹果、梨、草莓、葡萄等样品 北京市各大超市。

ACQUITY UPLC I-Class液相色谱仪、Xevo TQS质谱仪（配有电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源及Masslynx4.1数据处理系统） 美国Waters公司；GL-20G-II型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；FE20型实验室pH计 瑞士Mettler Toledo公司；BSA224S-CW型电子天平 感量0.1 mg，德国Sartorius公司；PL2002型电子天平 感量0.01 g，瑞士Mettler Toledo公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司；ZD-85型气浴恒温振荡器 常州国华电器有限公司；QL-8BB型旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；L18-Y915S型食品粉碎机 九阳股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制 混合标准溶液：分别移取一定体积的9种真菌毒素标准溶液于10 mL容量瓶中，加入适量甲醇稀释并定容至刻度线，得到混合标准工作溶液，其中PAT质量浓度为500 μg/L，其余8种真菌毒素质量浓度均为100 μg/L。

空白基质溶液：另取经检测不含9种真菌毒素的样品，按照1.2.2节进行样品前处理，制备空白基质溶液待用。

基质混合标准溶液：分别移取一定体积的9种真菌毒素标准溶液于10 mL容量瓶中，加入适量空白基质溶液稀释并定容至刻度线，配制不同质量浓度的系列基质混合标准工作溶液。其中，PAT的标准工作曲线浓度为 5、10、50、100、250、500 μg/L，其余8种真菌毒素的标准工作曲线浓度均为1、5、10、20、50、100 μg/L。

所有黏度测量的方法，都有一定的局限性和适用范围[5-6]。而目前在合成树脂行业，实验室测量最多的是旋转法，包括旋转黏度计和旋转流变仪。具体型号有布氏旋转黏度计、NDJ79旋转黏度计、锥板高温黏度计等。用于聚合反应终点判断、中间产品过程监测、最终成品质量检验。

10 mmol/L柠檬酸-乙腈溶液：称取1.92 g（精确到0.1 mg）柠檬酸于1 L容量瓶，加入乙腈溶解并定容。

1.2.2 样品前处理 参考文献[4, 24]中的前处理条件进行优化，具体如下：称取10 g（精确到0.01 g）匀浆试样置于50 mL离心管中，加入15 mL 10 mmol/L柠檬酸-乙腈溶液置于气浴恒温振荡器中振荡10 min，再加入烘干后的3.0 g氯化钠，涡旋振荡1 min，5000 r/min离心5 min。吸取6 mL有机相置于内含300 mg无水硫酸镁、200 mg C的10 mL离心管中，涡旋振荡0.5 min，常温静置5 min后，过0.22 μm有机滤膜于样品瓶中，待测分析。

加标阴性样品前处理：选取经检测不含9种真菌毒素的样品，在50 mL离心管中称取10 g（精确到0.01 g）匀浆试样，分别加入低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液（具体添加量详见表4），按照上述方法进行样品前处理。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C柱（2.1×100 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；流速：0.2 mL/min；流动相：A 为乙腈，B为0.05%甲酸-水溶液；梯度洗脱程序：0～0.5 min、90%B；0.5～1.0 min、90%～40% B；1.0～3.0 min、40%～10% B；3.0～4.0 min、10% B；4.0～8.0 min、90% B。

1.2.4 质谱条件 离子源：ESI；扫描方式：正、负离子同时扫描；毛细管电压：2.5 kV；离子源温度：150 ℃；锥孔电压：30 V；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量：650 L/h；碰撞气：高纯氩气；检测模式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）。

1.2.5 定性定量方法 结合质谱扫描所得质量数，采用两个碎片子离子进行定性和定量，以响应较强、稳定较好的子离子的质荷比（m/z）作为定量离子，响应次强、干扰少的子离子作为定性离子。

1.3 数据处理

通过Waters Masslynx仪器配置工作站系统进行数据采集及定性、定量分析，利用Excel软件进行数据分析及图形绘制。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

混合标准溶液直接进样，根据化合物的性质，先对9种目标物进行Q1 MS Scan母离子全扫，确定一级质谱碎片离子母离子质荷比（m/z）并优化锥孔电压，得到目标物的母离子和质谱参数。发现PAT在负离子模式下响应值高，分子离子峰为[M-H]；而其它8种化合物在正离子模式下响应值高，其中BEA分子离子峰为 [M+NH]，ALT、TeA、AOH、AME、TEN、OTA和CIT均为[M+H]。其次在Q2 MS/MS daughter Scan子离子扫描模式下进行二级质谱扫描，每个化合物选择两对特征离子对，以响应较强、稳定较好的碎片离子的质荷比作为定量离子，响应次强、干扰少的子离子作为定性离子，优化碰撞能量，确定质谱参数，9种真菌毒素MRM质谱参数见表1。

表1 9种真菌毒素检测质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for 9 mycotoxins

2.2 色谱条件的优化

本研究比较了 CQUITY UPLC BEH C柱、ACQUITY UPLC HSS T3柱和 ACQUITY UPLC BEH HILIC柱对目标物的分离效果。结果发现，使用HSS T3柱时，ALT和TeA峰形较差，响应值较低；使用BEH HILIC柱时，ALT、PAT、TeA三种化合物均不出峰；而BEH C柱能够在5 min内较好地分离9种化合物，且峰型更加对称，故选定BEH C柱作为分析色谱柱。

图1 9种真菌毒素的MRM色谱图Fig.1 The MRM chromatograms of 9 mycotoxions

2.3 提取剂的选择

大多数真菌毒素易溶于有机溶剂，乙腈和甲醇是目前最常用的两种提取溶剂，甲醇比乙腈具有更好的溶解性，易将样品中的酸、酚、脂肪、色素等物质提取出来，致使提取液中杂质较多，不利于后续的盐析和净化。由于降低提取溶剂pH能提高部分毒素的稳定性和回收率，因此本实验比较了乙腈、10 mmol/L 柠檬酸-乙腈、10% 甲酸-乙腈和0.1%乙酸-乙腈4种提取溶剂对9种真菌毒素提取效果的影响。

结果如图2所示，采用纯乙腈提取时，BEA回收率为136.7%，TeA回收率为76.4%，其余7种真菌毒素回收率为81.6%～104.1%。对乙腈进行3种不同程度的酸化后，BEA回收率分别降低为90.6%、85.8%、86.8%，TeA回收率分别提高为 90.7%、78.7%、86.5%。以10%甲酸-乙腈为提取溶剂时，PAT回收率最低，为74.2%。采用10 mmol/L柠檬酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈提取时，9种真菌毒素的回收率分别为86.0%～97.9%、81.5%～92.5%，考虑到柠檬酸更为经济环保，因此选用10 mmol/L柠檬酸-乙腈溶液作为提取溶剂。

图2 不同提取剂对9种真菌毒素回收率的影响Fig.2 Effects of different extractants on the recovery of 9 mycotoxins

2.4 净化剂的选择

在毒素提取的过程中，水果样品中的色素、有机酸、糖类物质、酚类物质等组分也被部分提取，这不仅会影响痕量目标物的检测，也会对色谱、质谱系统造成污染，为降低基质效应，需要对提取液进行净化。参考QuEChERS技术中的净化方法，选择常用的PSA和C吸附剂，C作为非极性吸附剂能够吸附基质中的非极性物质，有效去除样品中的脂质、糖类等有机化合物；PSA是一种碱性吸附剂，在结构上有两个氨基，可以通过氢键结合去除基质中的碳水化合物、有机酸、色素等。本研究比较了不同用量的PSA和C净化对毒素回收率的影响。

结果如图3所示，在100～400 mg用量下的PSA对AOH、TeA、OTA和CIT均有不同程度的吸附，其回收率为22.8%～68.4%；而C的净化效果较好，当用量为200 mg时，9种真菌毒素的回收率最佳，为88.5%～108.9%。张晓男等、王玉娇等在研究干/鲜果品中多种真菌毒素的提取方法时，也发现经C吸附剂净化后，多种真菌毒素的回收率分别在75.6%～111.8%和77.5%～103.7%之间，结果较为满意。因此，本实验选用200 mg C进行净化处理。

图3 净化剂对9种真菌毒素回收率的影响Fig.3 Effects of different purification reagents on the recovery for 9 mycotoxins

2.5 基质效应

为评价基质效应，采用基质标与溶剂标曲线斜率的比值考察了9种目标毒素在5种水果中的信号增强/抑制程度（signal suppression/enhancement, SSE），SSE值大于1.2表示存在基质增强效应，小于0.8表示存在基质抑制效应，在0.8～1.2之间则视为基质效应影响不大。测定结果如表2所示，在5种水果样品中，PAT、ALT、AME和AOH基质抑制效应明显（＜0.8），TEN、TeA基质增强效应明显（＞1.2）；CIT仅在樱桃样品中基质抑制效应明显；而BEA和OTA，在5种水果样品中的基质效应尚在可接受范围内（0.8～1.2）。因此本实验采用空白基质外标曲线法进行定量，以补偿基质效应。

表2 9种真菌毒素的基质效应Table 2 Matrix effects of 9 mycotoxins

2.6 方法学验证

2.6.1 方法的线性关系、LODs和LOQs 取空白桃样品，按照1.2.2进行样品前处理，配制一系列浓度的基质混合标准工作液，上机测定后，分别以9种真菌毒素的色谱峰面积为纵坐标（Y），对应的质量浓度为横坐标（X），进行线性回归分析，计算回归方程和相关系数，并根据信噪比（S/N）确定LOD（S/N=3）和LOQ（S/N=10），结果见表3。PAT的曲线浓度范围与其它毒素不同，主要考虑了PAT的限量水平、仪器响应值等因素。各目标物在各自质量浓度范围内，峰面积与质量浓度呈现良好的线性关系，在0.9991～0.9999之间。PAT的LOD和LOQ分别为 1.676、5.587 μg/kg，满足 GB 2761-2017和 GB 5009.185-2016规定的测定要求。其它8种真菌毒素的LODs为 0.004～0.122 μg/kg，LOQs为 0.014～0.406 μg/kg，相关毒素均低于SN/T 4259-2015中制定的LODs，表明本方法具有较好的灵敏度和良好的定性定量分析能力。

表3 9种真菌毒素的线性范围、LODs和LOQs（n=6）Table 3 Linear range, LODs and LOQs of 9 mycotoxins (n=6)

2.6.2 回收率与精密度 选取空白桃和樱桃样品为本底，对9种真菌毒素进行低、中、高3个浓度水平的加标回收实验，在优化的实验条件下，每个加标水平重复测定6次，分别计算加标回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表4。在2种水果基质中，各毒素在低水平添加量下的平均回收率为84.5%～106.5%，RSDs为0.8%～4.0%；在中水平添加量下的平均回收率为85.9%～113.2%，RSDs为1.1%～2.9%；在高水平添加量下的平均回收率为86.1%～111.3%，RSDs为0.7%～3.3%，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的技术要求，表明本方法具有良好的准确度和精密度。

表4 9种真菌毒素的加标回收率和RSDs （n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of 9 mycotoxins (n=6)

2.7 实际样品测定

采用本研究建立的方法对从超市购买的草莓（10份）、樱桃（5份）、葡萄（10份）、苹果（10份）、梨（10份）共计45份样品进行检测，结果发现3份样品中检出真菌毒素，分别为樱桃样品2份、葡萄样品1份，阳性率为 6.67%，所检测到的真菌毒素有PAT（检出率 6.67%）、ALT（检出率 6.67%）、TeA（检出率 4.44%）、AOH（检出率 2.22%）、AME（检出率2.22%）、TEN（检出率 2.22%）和 BEA（检出率2.22%）。如表5所示，有 2份樱桃样品共检出PAT、ALT、TeA和BEA 4种真菌毒素，1份葡萄样品中检出 PAT、ALT、TeA、AOH、AME和 TEN 6种真菌毒素。

表5 市售水果中真菌毒素的检测结果Table 5 Detection results of mycotoxins in commercial fruits

PAT和Ts是水果中污染最为广泛、危害最大的重点毒素，其产毒真菌是樱桃和葡萄采后贮藏过程中的主要病原菌，同样广泛污染蔬菜、粮食、油料等作物，在草莓、樱桃、葡萄、苹果、梨、桃等果品中均有检出。据报道，新鲜水果中很少有PAT产生，由青霉、曲霉等引起的腐烂水果样品中，PAT阳性率和检出浓度较高。链格孢菌可在水果贮运过程中的低温潮湿环境下生长，易于含水量和水分活度高的水果中增殖，浆果类水果的毒素检出率较高。本次超市抽检的小粒、易腐的樱桃和葡萄中，部分样品均含有PAT和ALT，而9种真菌毒素在草莓、苹果、梨样品中均未检出，可能与水果的新鲜程度、包装形式及贮藏条件等因素有关。

3 结论

本研究建立了QuEChERS前处理方法结合UPLC-MS/MS技术同时测定水果中9种真菌毒素的分析方法。实验优化了色谱质谱条件，使9种毒素拥有较合适的出峰时间、较好的峰形和较高的响应值，并通过优化提取溶剂、净化方法等前处理条件有效减少样品的基质干扰。建立的检测方法中，9种真菌毒素在5 min内完成色谱分离分析，在各自质量浓度范围内线性关系良好（＞0.999），检出限低，灵敏度高。桃和樱桃样品中低、中、高3个添加浓度水平的加标回收率在84.5%～113.2%之间，RSDs为0.7%～4.0%（n=6），结果较为满意。与以往单一水果种类中以Ts为主的检测方法相比，本方法操作简单、快速、毒素种类多、适用范围广，方法学验证及实际样品检测结果表明其灵敏度高、精密度好、实用性强，可以实现9种真菌毒素的有效分离和准确定量测定，满足水果中痕量毒素定量分析的要求，对监测、评估水果中多组分真菌毒素的污染风险评估和确证检测具有参考意义。

实际样品测定结果显示，有2份樱桃样品共检出PAT、ALT、TeA和BEA 4种毒素，1份葡萄样品检出 PAT、ALT、TeA、AOH、AME和 TEN 6种毒素，其余样品中均无毒素检出。实验结果表明售价较高、货架期较短的小粒、易腐类水果，在贮藏、销售过程中，存在真菌毒素混合污染的安全隐患，应给予持续关注。目前针对水果中的真菌毒素限值标准相关甚少，我国仅对苹果、山楂及其制品中的PAT规定了限值和测定方法，有必要健全水果中的真菌毒素限量标准及检测标准。