产细菌素植物乳杆菌的筛选及其细菌素对大黄鱼保鲜效果

许华娣，高腾琪，崔子杭，柳春胜，盘赛昆，杨 杰

（江苏海洋大学食品科学与工程学院，江苏连云港 222005）

乳酸菌（Lactici acid bacteria，LAB）是一类能利用并发酵碳水化合物（主要指葡萄糖）产生大量乳酸的细菌的统称，广泛分布在传统发酵食品、动物肠道、饲料和淤泥等生态环境中，其中发酵食品是拮抗性乳酸菌的重要来源之一。植物乳杆菌是一种常见的乳酸菌，在发酵碳水化合物的过程中可产生细菌素、过氧化氢和双乙酰等抑菌物质。细菌素不仅具有抗食源性致病菌和食品腐败菌的特点，而且具有高效、无毒、无残留、无抗药性等优点，目前在食品工业、生物医药以及畜牧养殖等方面应用广泛。

近年来，已有大量关于乳酸菌细菌素的研究报道。赵圣明等通过硫酸铵沉淀、Sephadex LH-20凝胶层析纯化、Hitrap QFF离子交换层析纯化和反向高效液相色谱C柱纯化得到了单一活性抑菌组分，对荧光假单胞菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和肠炎沙门氏菌具有明显的抑制效果。马国涵等通过乙酸乙酯萃取、超滤分离、Sephadex G-25过滤层析、HPLC从LP1-4发酵上清中分离得到一种细菌素，对铜绿假单胞菌等8株指示菌都具有良好的抑菌特性。由此可见，植物乳杆菌细菌素具有广谱抗菌作用使其在食品保鲜方面具有广泛的应用前景。

大黄鱼（Large yellow croaker），是我国最大规模的海水养殖鱼类和8大优势出口养殖水产品之一，其经济价值和营养价值比较高，但是蛋白质和水分含量高导致极易腐败，不仅会对消费者健康产生不利影响，而且会造成相当大的经济损失。此外，鲜鱼较好的口感、中国人吃整鱼的饮食习惯以及大黄鱼的体型特征不适于切片方式销售等因素，如何安全有效实现大黄鱼整鱼保鲜是亟待解决的实际问题。目前，已有多种保鲜方式被应用于大黄鱼保鲜，相较于其他保鲜方式，生物保鲜的安全指数更高。生物保鲜剂分为植物源、动物源以及微生物源保鲜剂，植物源和动物源的保鲜剂应用于水产品保鲜比较广泛，而微生物源的比较少，赵钰实验发现LLl 103粗提物能抑制大黄鱼腐败菌生长，延长其货架期，细菌素最佳浓度为0.8 mg/mL。本研究从传统发酵食品中筛选出产细菌素的植物乳杆菌MMB-11，并将其细菌素粗提液应用于大黄鱼整鱼的保鲜，以期为安全高效的大黄鱼微生物源的生物保鲜剂开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

发酵鲫鱼和卤水 贵州省黔东南州农家；虾酱连云港市巨龙路菜场；酸豇豆 南京六合农家；金黄色葡萄球菌（）CICC 23656、希瓦氏腐败菌（）ATCC 49138、嗜水气单胞菌（）MCCC 1A00-190 实验室保藏菌株；大黄鱼（490～510 g） 购自连云港家得福超市；过氧化氢酶200000 U/mg、蛋白酶K 30 U/mg、胰蛋白酶250 U/mg、胃蛋白酶3000 U/g

购自阿拉丁公司；乳酸菌生化鉴定试剂盒 海博生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

YXQ-LS-50SI立式压力蒸汽灭菌器 上海讯博实业有限公司医疗设备厂；DK-S24型电热恒温水浴锅、DNP-9126型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；PHS-3CW Microprocessor pH/mV Merer 上海理大智能电子有限公司；SBS-160数控计滴自动部分收集器、DNL-N电脑数显定时恒流泵 上海沪西分析仪器厂有限公司；D-37520高速冷冻离心机 美国赛默飞世尔科技有限公司；3730XL测序仪 美国ABI；SH2-D（Ⅲ）循环水式真空泵 上海越众仪器设备有限公司；RE52-AA旋转蒸发仪

上海亚荣生化仪器厂；TMS-Pro质构仪 北京盈盛科技有限责任公司；HX-4GM无菌均质器 上海沪析实业有限公司；BCD-537WLDPC冰箱 海尔智家股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的筛选 分别称取1 g酸鱼、卤水、虾酱和酸豇豆，接种到装有50 mL MRS液体培养基的蓝盖玻璃瓶，37 ℃富集培养48 h后用生理盐水进行梯度稀释，选取10、10、10涂布到MRS固体培养基平板上，涂布好的平板37 ℃培养48 h，挑取白色不透明、边缘整齐并且有明显溶钙圈的菌落37 ℃发酵48 h，测定上清液的抑菌活性。

1.2.2 乳酸菌发酵上清液的制备 参照孙杰等的方法并修改，将筛选出的乳酸菌按照1%的接种量接种到2000 mL MRS液体培养基中，37 ℃培养48 h，按照8000 r/min、4 ℃离心15 min，得到发酵上清液，4 ℃冰箱保藏备用。

1.2.3 指示菌菌悬液的制备 参照马国涵等的方法并修改，将金黄色葡萄球菌（）CICC 23656、希瓦氏腐败菌（）ATCC 49138、嗜水气单胞菌（）MCCC 1A00190按照1%的接种量分别接种于50 mL琼脂培养基中，37 ℃培养12 h，于4 ℃冰箱保藏备用。

1.2.4 抑菌活性的测定 参照高鹏的方法，以金黄色葡萄球菌（）CICC 23656、希瓦氏腐败菌（）ATCC 49138、嗜水气单胞菌（）MCCC 1A00190为指示菌，采用打孔法，每个孔中加入50 μL的乳酸菌上清液，通过测量抑菌圈直径的大小测定乳酸菌的抑菌活性。

1.2.5 乳酸菌的鉴定

1.2.5.1 乳酸菌的形态特征 将保藏的乳酸菌挑取一环进行三区划线，观察单菌落的形态特征。然后挑取单菌落接种于50 mL 的MRS液体培养基中，37 ℃培养48 h，取适量发酵液进行革兰氏染色，镜检观察。

1.2.5.2 生理生化鉴定 参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和乳酸细菌分类鉴定及实验方法对复筛出的菌株进行形态观察，使用乳酸菌鉴定试剂盒进行乳酸菌生理生化鉴定。

1.2.5.3 16S rDNA鉴定及系统发育树 基于16S rDNA的分子生物学检验：将复筛的菌株按照1%的接种量接种于MRS液体培养基中，37 ℃培养12 h，取细菌培养液1 mL，10000 r/min离心1 min，倒弃培养液，加入180 μL溶菌酶振荡使菌体重悬，37 ℃水浴 30 min，加入 20 μL Proteinase K，振荡混匀，再加入Buffer GB，振荡混匀，70 ℃水浴10 min，然后过柱纯化，DNA产物保存于-20 ℃。

PCR扩增引物选择细菌通用引物：27F和1492R；PCR 反应的总体积为 50 μL：dd HO 38 μL，10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L MgCl3 μL，dNTP 2.5 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，DNA 聚合酶 0.5 μL，模板 1 μL；反应程序：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性 30 s；54 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 90 s，35 个循环；72 ℃ 终延伸5 min。

经过PCR扩增得到的目的基因片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列检测。将测序得到的序列提交GenBank比对，再用MEGA 7.0软件构建系统发育树。

1.2.6 乳酸杆菌产抑菌物质的确定

1.2.6.1 乳酸的排除 参照高鹏的方法，菌株MMB-11活化发酵结束后8000 r/min，4 ℃下离心15 min弃沉淀取上清，用1 mol/L HCl和NaOH溶液将发酵上清液的pH调整至4.0、4.5、5.0、5.5，测定相同pH下MRS培养基的抑菌活性，排除酸对抑菌活性的影响。

1.2.6.2 过氧化氢的排除 参照高鹏的方法，取10 mL上清液pH调整至过氧化氢酶的最适pH7.0，然后取6 mL，添加过氧化氢酶6 mg，振荡混匀后，37 ℃水浴保温2 h，选择同样加酶处理的MRS液体培养基作为对照。水浴结束后测定抑菌活性，确定抑菌物质是否为过氧化氢。

1.2.6.3 蛋白酶水解实验 参照高鹏的方法，取40 mL离心上清液分成四份，一份不做处理作为对照，其余分别调整 pH1.9、8.0、7.9，各取 6 mL，分别添加胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K 6 mg，振荡均匀，37 ℃水浴保温2 h，测定离心上清液和酶处理组的抑菌活性，确定抑菌物质是否为细菌素。

1.2.7 乳酸杆菌产细菌素分离纯化及稳定性实验

1.2.7.1 醇沉水提法初步分离MMB-11细菌素 参照刘苗等的方法，将MMB-11的浓缩发酵上清液取出放在烧杯中，缓慢加入无水乙醇并搅拌均匀，使烧杯中无水乙醇的最终浓度为75%，将该烧杯于4 ℃的冰箱中放置12 h后按照4 ℃，8500 r/min离心15 min，分别测定上清和沉淀的抑菌活性。

1.2.7.2 Sephadex LH-20层析分离MMB-11细菌素参照赵圣明等的方法并修改，将1.2.6.1中得到的上清浓缩并定容至50 mL，过滤后沿层析柱壁缓慢加样3 mL，用 60% 色谱级甲醇作为流动相进行洗脱，洗脱速度为0.7 mL/min，自动部分收集器设定为每管收集3 min。洗脱结束后，收集各管组分并编号，测定各管的抑菌活性。

1.2.7.3 抑菌物质的热稳定性实验 参照Ren等的实验，取1 mL细菌素粗提液，分别将其置于40、60、80、100 ℃ 水浴锅保温处理 20 min，121 ℃ 高压灭菌处理15 min，测定其抑菌活性。

1.2.7.4 抑菌物质的pH稳定性实验 参照Digaitiene等的实验，取1 mL细菌素粗提液，用1 mol/L的HCl和NaOH溶液将其pH分别调整至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，保持 2 h后调回发酵上清液的初始pH，以未处理的发酵上清液为对照，测定其抑菌活性。

1.2.8 植物乳杆菌MMB-11细菌素在大黄鱼保鲜中的应用

1.2.8.1 样品处理 将大黄鱼去鳞、去腮、去除内脏之后洗净晾干，然后随机分成三组，空白组（C组）的大黄鱼不做任何处理，阳性对照组（N组）用1 g乳酸菌链球素加20 mL稀盐酸配制成0.5% Nisin溶液涂抹大黄鱼，MMB-11组（P组）用2000 mL发酵液分离纯化的MMB-11的细菌素粗提液涂抹大黄鱼，将处理后的大黄鱼装入无菌密封袋，4 ℃冰箱保藏，每隔3 d取样测定。

1.2.8.2 感官评价 参照郭儒岳等的方法并稍作修改，由6名经过水产品质量培训的食品加工与安全专业研究生组成评估小组根据下列评分表从大黄鱼气味、肌肉组织、弹性、颜色、粘液情况定期（3 d）进行综合评价（表1），综合评分结果为各项得分之和的平均值。

表1 大黄鱼的感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria of large yellow croaker

1.2.8.3 pH的测定 参照GB 5009.237-2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》进行测定，分别称取C组、N组以及P组5 g鱼肉于无菌均质袋，加入50 mL煮沸冷却的蒸馏水拍打均质2 min，后浸渍30 min，4000 r/min，离心10 min，测定上清液的pH。

1.2.8.4 菌落总数（TVC）的测定 参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行测定，将涂布好的平板于30 ℃恒温培养箱中培养72 h，记录稀释倍数和相应的菌落总数。

1.2.8.5 挥发性盐基氮（TVB-N）的测定 参照GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》修改用半自动凯氏定氮仪进行测定，以重复性条件下获得的三次独立测定的算数平均值表示。

1.2.8.6 质构特性（TPA）的分析 用解剖刀在CYC和WYC肌侧线上方的中间位置切开，将获得肌肉部分切割成2 cm×2 cm×0.5 cm的小块。使用平底柱形探头p50（5 mm直径），模拟人牙齿咀嚼食物，对大黄鱼鱼块进行2次压缩质构仪质地多面剖析模式测试。测试条件如下：探头下降速率3.0 mm/s；测试速率0.5 mm/s；探头回程速率3.0 mm/s；测试距离为10 mm；停留间隔时间1 s；触发力5 g；环境温度：12～16 ℃。每次测3个样品，每个样品测3次，取平均值。

1.3 数据处理

每次实验重复三次，使用SPSS 25统计软件对实验数据进行方差分析，采用 Duncan’s Multiple Range Test中的单因素方差分析（＜0.05）分析数据之间的差异性，以平均值±标准误差表示数值。采用不同的字母表示同一贮藏时间不同处理方式之间存在显著性差异，并用Origin 2019和MEGA 7.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 产抑菌物质乳酸菌的初筛与复筛

在初筛的235株菌中，根据抑菌圈直径的大小，选取编号菌株 X8、X9、X14、X15、A16、L73、S49、MMB-11作为复筛的研究对象，结果如表2所示，MMB-11对金黄色葡萄球菌和希瓦氏腐败菌的抑菌圈直径分别为11.70±0.05 mm和11.40±0.05 mm，与其他菌株相比，其综合抑菌活性最高，因此选择MMB-11作为后续研究菌株。

表2 不同菌株的抑菌圈直径Table 2 Diameters of inhibition zone of different strains

2.2 植物乳杆菌MMB-11的鉴定

2.2.1 乳酸菌的形态特征结果 MMB-11菌落形态如图1所示，MMB-11菌落呈不透明的乳白色，边缘整齐且表面光滑，是典型的乳酸菌的生长特征；菌体经革兰氏染色后显微镜镜检观察，其颜色呈紫色，为革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状或弯杆状，有时呈链状，无芽孢和鞭毛。

图1 菌株MMB-11菌落形态及革兰氏染色图Fig.1 Colony morphology and Gram staining of MMB-11 strain

2.2.2 乳酸菌的生理生化鉴定结果 根据表3的生理生化鉴定结果表明菌株MMB-11发酵葡萄糖不产生气体，明胶液化结果呈阴性，不能水解精氨酸产氨气，可发酵葡萄糖、果糖、阿拉伯糖等多种糖，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》，表明该菌株为植物乳杆菌。

表3 MMB-11生理生化鉴定结果Table 3 Physiological and biochemical identification results of MMB-11 strain

2.2.3 菌株MMB-11 16S rDNA 鉴定结果及系统发育树 使用细菌基因组提取试剂盒提取菌株MMB-11的DNA后，以其为模板进行PCR扩增，回收扩增产物并进行测序，经过同源性比较，发现其与植物乳杆菌的相似度达95%，因此在综合其形态特征观察结果、生理生化试验结果和16S rDNA序列分析的结果基础上，鉴定其为植物乳杆菌（图2），命名为植物乳杆菌MMB-11。

图2 MMB-11的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of MMB-11

利用MEGA7.0软件构建MMB-11系统发育树，在系统发育树中，菌株MMN-11与植物乳杆菌在同一分支。

2.3 菌株MMB-11产抑菌物质的鉴定

2.3.1 酸的排除 酸排除实验结果如图3，在发酵上清液的pH由4.0到5.5的过程中，其对金黄色葡萄球菌、希瓦氏腐败菌和嗜水气单胞菌的抑菌活性在逐渐变弱，pH为5.5时仍有一定的抑菌活性，而对照组MRS液体培养基在pH5.0时就已经完全没有抑菌活性。说明在发酵上清液中，排除酸的抑菌作用后，存在其他具有抑菌作用的物质。

图3 MMB-11排酸实验结果Fig.3 Results of MMB-11 acid removal experiment

2.3.2 过氧化氢的排除 使用过氧化氢酶酶解上清液，若上清液中的抑菌物质为HO，经过氧化氢酶处理后的上清液抑菌活性将显著降低。实验结果如图4所示，经过氧化氢酶处理后，发酵上清液对于金黄色葡萄球菌、希瓦氏腐败菌、嗜水气单胞菌的抑菌活性并没有显著性变化，说明过氧化氢不是发酵上清液中起抑菌作用的主要物质。

图4 MMB-11排过氧化氢实验结果Fig.4 Results of MMB-11 hydrogen peroxide removal experiment

2.3.3 蛋白酶水解实验 细菌素都是蛋白质或者多肽，所以经蛋白酶水解处理发酵上清液后，上清液抑菌活性将显著下降。马国涵等通过蛋白酶水解实验确定了大菱鲆肠道中筛选出的乳酸菌可产细菌素，并分离纯化了植物乳杆菌LP1-4。如图5所示，经胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K水解后，与原发酵液相比，其抑菌活性呈现出不同程度地下降，且与对照组相比差异显著（＜0.05），说明MMB-11中的抑菌物质对酶敏感。因此，确定菌株MMB-11的发酵上清液中主要抑菌活性物质为细菌素。

图5 MMB-11蛋白酶水解实验结果Fig.5 Results of MMB-11 protease hydrolysis experiment

2.4 植物乳杆菌MMB-11细菌素分离纯化及其性质研究

2.4.1 醇沉水提分离细菌素 醇沉水提组分抑菌实验结果如图6所示，处理后上清仍具有显著的抑菌活性，而其沉淀没有抑菌活性，表明醇沉水提法处理可以有效富集抑菌活性物质，去除植物乳杆菌MMB-11发酵液中大量的蛋白、无机盐、多糖等杂质。

图6 MMB-11 醇沉水提组分抑菌活性Fig.6 Antibacterial activities of the components of MMB-11 by alcohol precipitation

2.4.2 Sephadex LH-20层析分离纯化细菌素 Sephadex LH-20层析后的抑菌结果如表4所示，MMB-11抑菌物质分布在第59管到第81管之间，并且抑菌活性随着洗脱体积的增加呈现先增强后下降的趋势，第71管收集的组分对金黄色葡萄球菌抑菌活性最大，抑菌圈直径为17.75±0.07 mm，第69管对希瓦氏腐败菌和嗜水气单胞菌抑菌活性最大，抑菌圈直径分别为18.25±0.05 mm和25.80±0.10 mm。将有抑菌活性的组分收集合并然后经旋转蒸发仪浓缩，置于4 ℃冰箱保存备用。

表4 Sephadex LH-20层析凝胶收集管抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of Sephadex LH-20 gel chromatography collection tube

2.4.3 植物乳杆菌MMB-11细菌素粗提液热稳定性研究 从图7可以看出，经过40、60、80、100 ℃保温处理20 min以及121 ℃处理15 min之后，MMB-11的细菌素粗提液对于金黄色葡萄球菌、希瓦氏腐败菌和嗜水气单胞菌的抑菌圈与原来相比略有变化，40、60、80、100、121 ℃ 处理之后其抑菌活性变化不显著（＞0.05），表明植物乳杆菌MMB-11的细菌素粗提液具有良好的热稳定性。

图7 MMB-11细菌素粗提液温度耐受性Fig.7 MMB-11 bacteriocin crude extract temperature tolerance

2.4.4 植物乳杆菌MMB-11细菌素粗提液pH稳定性研究 从图8可以看出，植物乳杆菌MMB-11的细菌素粗提液的pH调整至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0后，其对于金黄色葡萄球菌的抑菌活性呈现下降趋势，但是仍然具有较强的抑菌活性，实验结果表明，植物乳杆菌MMB-11的细菌素粗提液具有良好的pH稳定性。

图8 MMB-11细菌素粗提液pH耐受性Fig.8 MMB-11 bacteriocin crude extract pH tolerance

2.5 MMB-11细菌素粗提液应用于大黄鱼保鲜

2.5.1 不同处理方式对大黄鱼感官评价的影响 大黄鱼的感官评价结果如图9所示，随着贮藏时间的增加，感官评价的分值呈下降趋势，保鲜效果的感官评价呈下降趋势。实验结果表明，Nisin处理组和MMB-11处理组可获得更好的感官评价，延长大黄鱼的鲜度接受时间，并且MMB-11处理组的感官评价明显优于Nisin处理组（＜0.05）。这与刘佳秀等的研究结果是一致的，这可能是由于大黄鱼中天然存在的微生物能够引起鱼肉腐败变质，但是MMB-11细菌素粗提液具有良好的抑菌作用，延缓了大黄鱼的腐败变质，因此，感官评价的结果更好。

图9 感官评价分值随着贮藏时间的变化Fig.9 The change of organoleptic evaluation scores in the process of storage

2.5.2 不同处理方式对大黄鱼pH的影响 由于微生物的作用以及鱼本身所含有的水解酶，大黄鱼在贮藏的过程中，其pH先下降后上升，可能由于保藏前期，大黄鱼中的糖原酵解产生乳酸，而到了保藏中期和后期，大黄鱼体内的内源组织蛋白酶释放出来了，加上微生物的作用导致抑菌物质中的蛋白质分解产生氨气和胺类等碱性挥发性物质，使得大黄鱼的pH在后期上升。图10反映了4 ℃贮藏期间大黄鱼在3种处理方式下pH的变化趋势，与唐智鹏等以及许萍等的研究结果是一致的，表明MMB-11处理组能够很好地延缓鱼肉pH的变化。

图10 pH随着贮藏时间的变化Fig.10 The change of pH in the process of storage

2.5.3 不同处理方式大黄鱼菌落总数（TVC）的变化菌落总数测定可以判定食品的细菌污染程度以及食品的卫生质量，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。实验结果如图11所示，随着贮藏时间的延长，三组大黄鱼的细菌菌落总数呈上升趋势，这与高永悦等的研究结果一致，空白组的大黄鱼细菌菌落总数上升的最快，Nisin处理组的次之，MMB-11处理组的最小。参照SC/T 2809-2018，大黄鱼的一级鲜度，菌落总数≤10CFU/g，二级鲜度标准≤10CFU/g。第6 d时，MMB-11处理组的大黄鱼还处于一级鲜度，而Nisin处理组已经到了二级鲜度；到12 d空白组的细菌总数达到了1.10×10CFU/g，超出了二级鲜度，而Nisin处理组和MMB-11处理组还处于二级鲜度。结果表明，Nisin处理组和MMB-11处理组，可以有效抑制大黄鱼鱼肉中的细菌菌落总数，而且相较于0.5% Nisin溶液，MMB-11细菌素粗提液的保鲜效果更好。这可能由于大黄鱼中的优势腐败菌希瓦氏腐败菌是革兰氏阴性菌，Nisin主要抑制革兰氏阳性菌的生长，而MMB-11对阳性菌和阴性菌均有良好的抑制效果。因此，在MMB-11粗提液处理组的菌落总数显著低于其他组。

图11 菌落总数随着贮藏时间的变化Fig.11 The change of TAC in the progress of strorage

2.5.4 不同处理方式大黄鱼挥发性盐基氮（TVB-N）的变化 挥发性盐基氮（TVB-N）指动物性食品在腐败过程中，由于酶和细菌的作用，蛋白质分解产生的氨以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性，其含量越高，表明氨基酸被破坏的越多，特别是蛋氨酸和酪氨酸，因此营养价值受到很大影响。

三种不同方式处理的大黄鱼在冷藏期内挥发性盐基氮的变化曲线如图12所示，结果表明三组大黄鱼的挥发性盐基氮总体都呈现上升趋势，这与史国萃等的研究结果一致。空白组的挥发性盐基氮的值始终高于其他两组，且在12 d的时候达到了31.37±0.21 mg/100 g，超出了大黄鱼二级鲜度的标准30 mg/100 g。在3～9 d MMB-11处理组的挥发性盐基氮一直显著低于 Nisin处理组（＜0.05），到12 d时两者的数值没有显著差异。总的来说，在挥发性盐基氮这一指标上，Nisin处理组和MMB-11处理组的保鲜效果明显优于空白组（＜0.05），且MMB-11组效果在3～9 d时可以更好地抑制挥发性盐基氮的增长，这可能是与MMB-11处理组可以更好地延缓大黄鱼pH上升有关。

图12 TVB-N随着贮藏时间的变化Fig.12 The change of TVB-N in the progress of strorage

2.5.5 不同处理方式大黄鱼质构（TPA）的变化 质构分析如表5所示，研究了不同处理组对大黄鱼贮藏过程中的硬度、弹性、黏聚性、胶黏性、咀嚼性和黏附性的影响，贮藏时间为3 d，三种不同处理方式的大黄鱼各项指标没有显著差异；贮藏6 d时，硬度、弹性、咀嚼性均发生了显著变化；贮藏9 d时，硬度和黏聚性发生了显著变化；贮藏12 d时，黏附性和硬度发生了显著变化。结果表明在贮藏3 d时，三种处理方式对大黄鱼的质构影响不显著，在贮藏6～9 d时影响显著，12 d时对黏附力和硬度影响最为显著。

此外，从表5还可以发现不同处理方式的大黄鱼的硬度总体是上升趋势，但中间都出现了下降。这可能是大黄鱼在死后，贮藏初期由于肌肉本身柔软且富有弹性，而随着贮藏时间的增加，肌肉开始收缩变硬，使得其失去了弹性，进入了僵硬期，导致硬度相应上升，随后由于蛋白质受到内源蛋白酶和腐败微生物的降解导致蛋白分子结构发生变化，肌肉质地发生软化，弹性下降等变化。在弹性指标上，不同处理方式的大黄鱼在贮藏过程中总体上呈现出下降趋势，这与Jiao等的研究相一致。而黏聚性、胶黏性以及咀嚼性主要跟弹性和硬度相关，其变化趋势基本与弹性和硬度的变化趋势吻合。不同处理方式的大黄鱼黏附性总体呈下降趋势，这可能是由于细胞间的结合力变小从而使得肌肉组织没有那么紧密，这与感官评价评分相一致。因此，MMB-11处理组和Nisin处理组能够显著保持大黄鱼贮藏期间的品质，且MMB-11处理组效果更佳。

表5 不同贮藏时间的TPATable 5 The TPA in the process of storage

3 结论

本文从传统发酵食品中筛选得到一株植物乳杆菌MMB-11，对金黄色葡萄球菌、希瓦氏腐败菌和嗜水气单胞菌均具有良好的抑制作用，进一步通过抑菌成分分析以及蛋白酶水解实验确定发酵上清液中主要抑菌活性物质为细菌素，该细菌素对蛋白酶敏感，且具有良好的热稳定性和pH耐受性。最后通过感官评价、pH测定、菌落总数测定、挥发性盐基氮测定以及质构分析发现，相较于空白组和0.5% Nisin处理组，MMB-11细菌素组对大黄鱼具有良好的保鲜效果。研究结果表明，植物乳杆菌MMB-11在水产品绿色保鲜剂的开发方面具有潜在的应用价值，后续将对MMB-11的细菌素进行进一步的分离纯化并深入研究其相关特性、探索提高其细菌素产量的条件，为大黄鱼整鱼保鲜剂的开发提供理论基础。