酶法制备玉米皮膳食纤维的工艺优化及其功能性研究

汪 睿，姜彩霞，刘晓兰 ，郑喜群,,

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319；

2.黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术中心，黑龙江大庆 163319；

3.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；4.黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室，黑龙江齐齐哈尔 161006）

随着食品工业的不断发展，越来越多的精加工食品成为了人们饮食的主流产品。但摄入过多的精加工食品会导致部分营养物质的流失，同时也增加了肥胖症、高血压与高血脂的患病几率。糖类、脂肪及胆固醇会因膳食纤维的阻碍而降低其吸收率和利用率因此可以辅助控制餐后血糖，同时膳食纤维还可以降低脂类的消化，提高饱腹感，能够有效抑制肥胖症、高血脂和慢性肠道疾病等。2000年中国营养学会中提出，平均我国每人每天应摄入膳食纤维30 g左右，而实际我国人均摄入量仅为18.5 g。因此膳食纤维的开发对我国居民营养具有十分重要的意义。

在粮食作物中玉米的世界总产量最高，作为玉米加工的主要副产物之一的玉米皮占玉米总量的14%～20%，通常用于动物饲料。玉米皮主要由不溶性纤维、纤维素、半纤维素、低聚木糖、油脂、水分、淀粉及蛋白质组成，其中膳食纤维的含量约为总量的60%～70%，可作为膳食纤维的良好来源。通过扩大玉米皮的使用范围，并将其转化为增值产品具有重要的社会价值和市场前景。目前膳食纤维的制备方式大体分为三种，分别是化学法、物理法以及酶法。相较于其他两种制备方式，酶法制备具有条件温和、可控性强以及成本适中的特点。

本文采用酶法制备玉米皮膳食纤维，通过单因素实验和响应面优化确定最佳的制备工艺，并通过体外试验测定了其持水性、吸水膨胀性、胆固醇吸附性、持油性、葡萄糖吸附性以及对脂肪消化模型的影响，为玉米皮膳食纤维作为预防肥胖的功能性成分提供了理论依据，并对提高玉米皮的附加值，促进其综合利用起到了积极的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米皮 北京粮食集团有限责任公司；大豆油、玉米油、菜籽油、猪油 均从当地市场采购；碱性蛋白酶（2×10U/g） 南宁庞博生物有限公司；糖化酶（1.5×10U/g）、淀粉酶（2×10U/g） 天津诺奥科技有限公司；猪胆汁提取物、脂肪酶来自猪胰腺sigma-aldrich（上海）贸易有限公司；淀粉含量检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；其他试剂等均为分析纯。

K9860全自动凯氏定氮仪 海能仪器（上海）有限公司；TGL-16M离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UV-2501PC紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；DF-101智能磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米皮主要营养成分的测定

1.2.1.1 水分含量测定 采用快速水分测量法，称取1 g玉米皮于锡纸托盘上，放入水分测定仪中，设置温度110 ℃，时长10 min后读数。

1.2.1.2 灰分含量测定 参照国标方法GB 5009.4-2016，准确称取玉米皮2 g于坩埚中，放入马弗炉550 ℃灼烧4 h，取出后称重。

1.2.1.3 蛋白质含量测定 采用凯氏定氮法GB 5009.5-2016测定蛋白质残留量，称取样品1 g加入2.5 g催化剂（硫酸钾与硫酸铜15:1混合），倒入10 mL浓硫酸进行消化，消化完成将消化管放入全自动凯氏定氮仪记录数据。

1.2.1.4 淀粉含量测定 采用索莱宝淀粉试剂盒进行测定，称取0.1 g样品加0.8 mL蒸馏水匀浆，放置提取15 min，室温下4000 r/min离心10 min，取上清液在540 nm处测量吸光度。

1.2.1.5 膳食纤维含量测定 参照国标方法GB 5009.88-2014，称取1 g样品用碱性蛋白酶（300 U/mL）和-淀粉酶（10000 U/mL）分别酶解 30 min，4000 r/min离心 15 min，将沉淀用 70 ℃蒸馏水冲洗 2次，用78%乙醇、95%乙醇以及丙酮分别冲洗2次后，烘干过夜后称重，减去灰分与蛋白质即为不溶性膳食纤维含量。将离心后的上清液用4倍体积乙醇进行沉淀，收集沉淀将沉淀用78%乙醇、95%乙醇以及丙酮分别冲洗2次后，烘干过夜后称重，减去灰分与蛋白质即为可溶性膳食纤维含量。可溶性膳食纤维含量与不溶性膳食纤维含量之和即为总膳食纤维含量。文中若未强调可溶性均为总膳食纤维。

1.2.2 玉米皮膳食纤维的制备 参照Zheng等的方法，略做改动。玉米皮原料粉碎，过60目筛。采用两步酶解工艺，分别为蛋白酶酶解和淀粉复合酶（中温-淀粉酶与糖化酶，m/m=1:1）酶解，首先进行碱性蛋白酶水解，酶解后取出进行沸水浴灭酶，灭酶时间20 min，然后进行淀粉复合酶水解，对酶解液进行高温灭酶20 min后4000 r/min离心15 min，沉淀用4倍体积的95%乙醇进行醇洗，45 ℃真空干燥48 h得玉米皮膳食纤维。

1.2.3 单因素实验 酶法提取玉米皮膳食纤维可分为蛋白质的水解与淀粉的水解两步，因此围绕蛋白质水解和淀粉水解进行单因素实验设计，以达到提高最终产物中膳食纤维含量目的。

1.2.3.1 蛋白质水解单因素实验 以碱性蛋白酶添加量0.7%，酶解pH为9，酶解温度52 ℃，酶解时间3 h为固定条件，考察碱性蛋白酶添加量（0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%）、酶解 pH（8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）、酶解温度（48、50、52、54、56 ℃）、酶解时间（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h）对蛋白质残留量的影响。

1.2.3.2 淀粉水解单因素实验 以淀粉复合酶添加量0.8%，酶解pH为6.5，酶解温度65 ℃，酶解时间2 h为固定条件探究淀粉复合酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、酶解 pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、酶解温度（50、55、60、65、70 ℃）、酶解时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对淀粉残留量的影响。

1.2.4 响应面试验 为达到提高最终产物膳食纤维含量的目的，在单因素实验的基础上，从蛋白酶水解单因素中选择蛋白酶添加量与蛋白酶解时间，两个对蛋白质残留量波动影响较大的指标作为因素A、因素B，从复合淀粉酶单因素中选择复合酶添加量与复合酶酶解pH，两个对淀粉残留量波动影响较大的指标作为因素C、因素D，以膳食纤维含量作为响应值Y，进行响应面试验设计及优化，因素水平表见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 玉米皮膳食纤维理化功能特性分析

1.2.5.1 持水性的测定 参照López-marcos等的方法，略有修改。称取适量样品，放入50 mL离心管中加水配制成浓度为5%的溶液，混合均匀，在室温下静置4 h后，经4000 r/min离心15 min，称量离心后沉淀物重量，计算持水性公式如下：

式中：m为样品湿重（g）；m 为样品干重（g）。

1.2.5.2 膨胀性的测定 参照何晓琴等的方法，略有修改。称取样品1 g，置于20 mL量筒中，加入10 mL蒸馏水充分混匀，在25 ℃下静置18 h，膨胀性计算公式如下：

式中：v为初始样品体积（mL）；v为水合样品体积（mL）；m 为样品干质量（g）。

1.2.5.3 持油性的测定 参照汤小明等的方法，略有改动。称取适量样品，放入50 mL离心管中，加入适量食用油（样品与食用油质量比为1:8），使用大豆油、玉米油、菜籽油与猪油进行对照试验，混合均匀，在室温下静置4 h后，经4000 r/min离心15 min，称量离心后沉淀物重量，计算持油性公式如下：

式中：m为样品湿重（g）；m 为样品干重（g）。

1.2.5.4 葡萄糖吸附性的测定 参照刘倩等的方法，略加改动。称取1 g样品与100 mL的葡萄糖标准溶液（50 mmoL/L）混匀，置于37 ℃水浴中180 r/min搅拌吸附4 h，离心取上清液，利用DNS法测定上清液中葡萄糖的含量，葡萄糖吸附性计算公式如下：

式中：m为样品干重（g）；n为吸附前溶液中葡萄糖含量（mmoL）；n为吸附后溶液中葡萄糖含量（mmoL）。

1.2.5.5 胆固醇吸附性的测定 参照王红等的方法，略改动。取鸡蛋蛋黄加水配制成10%蛋黄稀释液，取30 mL蛋黄稀释溶液于烧杯中，用1 mol/L HCl将溶液 pH调至2.0（模拟胃环境）、0.1 mol/L NaOH将溶液pH调整为7.0（模拟小肠环境），分别加入1 g样品 37 ℃水浴振荡 2 h，4000 r/min离心15 min，吸取1 mL上清液在波长550 nm处测定吸光值，胆固醇吸附能力计算公式如下：

式中：m为样品干重（g）；n吸附前蛋黄溶液吸光度带入胆固醇标准曲线后所得胆固醇含量（mg）；n吸附后蛋黄溶液吸光度带入胆固醇标准曲线后所得胆固醇含量（mg）。

1.2.5.6 膳食纤维对体外脂肪消化模型的影响 参照Yang等的方法，略改动。取500 mg样品加30 mL水油混合液（含0.5%玉米油，经高速分散均质处理）37 ℃搅拌30 min。另取3.5 mL胆汁盐溶液（187.5 mg胆汁提取物溶解在3.5 mL PBS缓冲溶液中，pH7.0）和1.5 mL盐溶液（55 mg氯化钙和328.7 mg氯化钠溶于1.5 mL PBS缓冲溶液中，pH7.0）加入到样品混合物中，37 ℃搅拌，调节pH至7.0。再向上述混合物中加入2.5 mL新鲜配制的脂肪酶悬液（60 mg脂肪酶粉分散在2.5 mL PBS缓冲溶液中，pH7.0），分别在 5、15、30、60、90、120 min时添加 NaOH（0.1 mol/L），通过测量 NaOH（0.1 mol/L）的体积来监测释放的游离脂肪酸（FFAs），以不含膳食纤维样品作为对照，计算公式如下：

式中：C为NaOH溶液浓度（mol/L）；V为中和释放的游离脂肪酸所需的NaOH溶液滴定体积（mL）；MW 为玉米油的平均分子量（872 g/mol）；M为玉米油的初始质量（g）；2为假定所有三酰甘油都水解成两分子游离脂肪酸和一分子单酰甘油。

1.3 数据处理

根据 Box-Benhnken的试验设计原理，通过SPSS软件对数据进行处理与回归分析，并进行三次重复实验。

2 结果与分析

2.1 玉米皮主要成分分析

如表2所示玉米皮中蛋白质含量为8.53%，膳食纤维含量为65.34%，可知玉米皮中富含大量膳食纤维，若充分利用可大幅度提高玉米皮的潜在价值，并且可以为玉米皮的综合开发利用提供广阔的市场和发展前景。

表2 玉米皮主要成分含量Table 2 Content of main components in corn bran

2.2 玉米皮膳食纤维提取单因素实验

2.2.1 蛋白酶酶解条件对玉米皮中蛋白质残留量的影响 有研究发现，玉米皮中蛋白质以网状结构包裹部分淀粉颗粒，优先去除蛋白质组分更有利于玉米皮中淀粉组分的去除。由图1可知，随碱性蛋白酶添加量的增大，蛋白质残留量逐渐降低，当酶添加量到达0.7%时蛋白质残留量为3.14%，继续增大酶添加量，蛋白质残留量变化并不明显，这是由于定量的底物随酶添加量的增加逐渐达到饱和，并且酶添加量过多也会出现酶与酶之间相互抱团无法与底物充分接触。pH与蛋白质残留量成反比关系，当pH为10时蛋白质残留量2.97%，而后pH继续升高蛋白质残留量会略微回升，这种现象可能是由于越接近最适pH酶活性越高，因此蛋白质残留量逐渐下降，而发生回升现象的原因是由于pH过高导致碱性蛋白酶活性降低，从而影响到蛋白质的去除效果。蛋白质残留量随温度的升高而降低，当温度达到54 ℃时蛋白质残留量达到最低值，最低值为3.21%，温度继续升高蛋白质残留量也会升高，出现这种现象可能的原因首先是通过升高温度使得酶活性逐步提高，而后继续升温，过高的温度抑制了碱性蛋白酶的活性，从而导致蛋白水解效果降低。酶解时间对蛋白水解影响较大，随时间增长蛋白质残留量逐渐下降，接近3.5 h随时间的增长蛋白含量下降趋势逐渐变缓，这可能是由于定量的底物随酶解时间增加逐渐被完全水解，底物不断变稀导致酶无法与底物充分结合从而减缓酶解效率。经单因素实验不难发现温度与pH在经过最适条件后均出现回升，因此温度与pH采用最适条件，添加量（0.6%、0.7%、0.8%）与时间（3、3.5、4 h）进行进一步优化。

图1 蛋白酶酶解条件对玉米皮膳食纤维中蛋白质残留量的影响Fig.1 Effect of protease hydrolysis conditions on the protein residue in corn husk dietary fiber

2.2.2 淀粉复合酶酶解条件对玉米皮中淀粉残留量的影响 由图2可知，以膳食纤维中淀粉残留量为指标，当添加量超过0.8%，随添加量升高，酶解效果提升并不显著，这可能是因为底物与酶的比例逐渐达到饱和。pH对淀粉残留量影响较大，随pH升高淀粉残留量大幅度下降，当pH高于6.5时淀粉残留量变化趋势逐渐变缓，这可能是因为酶活性中心基团的解离程度逐渐变缓导致趋势变缓。随着温度的升高淀粉残留量在逐步减少，在65 ℃时达到最小值，其含量为0.58%，温度继续升高，淀粉残留量上升，这是由于温度过高抑制了复合酶活性。淀粉残留量随时间增加而减小，但2 h后随酶解时间增加淀粉残留量变化并不明显，这可能是由于酶解反应中底物浓度减小，减缓了酶解速率。经单因素实验可以看出温度在超过最适值后淀粉残留量出现回升因此将温度选择在最适条件65 ℃，时间在2 h后淀粉残留量下降仅为0.01%左右并且时间对淀粉残留量影响较小，因此将酶解时间确定为2 h。由于添加量与pH对淀粉残留量影响波动较大，因此进行进一步优化，添加量选择0.7%、0.8%、0.9%，pH选择6、6.5、7。

图2 淀粉复合酶酶解条件对玉米皮膳食纤维中淀粉残留量的影响Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis conditions of starch complex enzymes on starch residue in corn bran dietary fiber

2.3 玉米皮膳食纤维提取工艺回归模型的建立及方差分析

由上述实验表明，因素A（蛋白酶添加量）与因素B（蛋白酶酶解时间）对蛋白质残留量波动影响较大，因素C（淀粉复合酶添加量）与因素D（淀粉复合酶酶解pH）对淀粉残留量波动影响较大，且根据李晶试验可知蛋白残留量与淀粉残留量的降低会直接影响到最终产物中膳食纤维的含量。因此本试验用响应面进行优化，以A（蛋白酶添加量）、B（蛋白酶酶解时间）、C（淀粉复合酶添加量）、D（淀粉复合酶酶解pH）四个主要影响因素作为自变量，以玉米皮膳食纤维含量为响应值Y，采用Box-Behnken试验设计原理对其工艺参数进行优化，结果如表3所示。

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Response surface test design and results

对表3中数据进行二次多元回归拟合，得到回归方程 Y=85.67+0.31×A+0.66×B+0.25×C+0.73×D-0.46×AB-1.00×AC+0.34×AD-1.44×BC+1.44×BD-0.46×CD-1.30×A-1.58×B-1.57×C-0.87×D。

由表4可知，所建立的模型极显著（=40.19，＜0.0001），失拟项差异不显著（0.0928＞0.05），这表明方程对试验拟合程度较高，回归系数为0.9760，校正决定系数为0.9519，说明95.19%的响应值变化都可以用该模型解答。因此该模型对玉米皮膳食纤维得率进行分析和预测是可靠的。对回归方程显著性检验，结果表明A（蛋白酶添加量）、B（蛋白酶酶解时间）、D（淀粉复合酶酶解pH）对玉米皮膳食纤维含量影响极显著（＜0.01）；C（淀粉复合酶添加量）对玉米皮膳食纤维含量影响显著（＜0.05），交互作用下自变量之间均会相互影响，并且二次项均极显著（＜0.0001）。该模型对玉米皮膳食纤维含量进行分析和预测是可靠的。

表4 回归方程方差分析及结果Table 4 Analysis of variance of regression equation and results

2.4 响应面分析

图3显示了响应值随着各因素水平的增加而增加，达到最高点后，响应值开始逐渐减小。其中玉米皮膳食纤维的提取中AC（蛋白酶添加量和淀粉复合酶添加量）、BC（蛋白酶酶解时间和淀粉复合酶添加量）和BD（蛋白酶酶解时间和淀粉复合酶酶解pH）交互作用极显著（＜0.01），AB（蛋白酶添加量和蛋白酶酶解时间）和CD（淀粉复合酶添加量和淀粉复合酶酶解pH）交互作用显著（＜0.05）且等高线均表现出椭圆形。

图3 AB、AD、CD、AC、BC和BD交互作用的响应面图Fig.3 The response surface diagrams of the interaction of AB, AD, CD, AC, BC and BD

2.5 提取工艺优化和可靠性验证结果

为进一步确认对玉米皮膳食纤维含量影响较大的四个因素的最佳条件，利用Design-Expert软件进行分析，通过分析结果可以得到最大膳食纤维含量的条件参数：蛋白酶添加量为0.742%、蛋白酶酶解4 h、淀粉复合酶添加量为0.727%、淀粉复合酶酶解pH为6.76，在此工艺参数下玉米皮膳食纤维含量理论值为86.80%。依据此工艺参数进行三次验证试验，得到实际玉米皮膳食纤维含量实际平均值为86.65%，与理论值相差不大，这表明该模型优化后的玉米皮膳食纤维提取工艺较为可靠。

2.6 玉米皮膳食纤维理化功能性质分析

如表5所示酶法制备的玉米皮膳食纤维中主要以不溶性膳食纤维为主，可溶性膳食纤维仅为1.98%，制备的膳食纤维具有良好的持水性（WHC）和吸水膨胀性（SWC），分别为 3.93±0.17 g/g、3.70±0.20 mL/g。有研究结果表明，WHC与膳食纤维的结构有一定的关系。当接触面积和膳食纤维中亲水性基团增加时，水可以保留在亲水部分或网状纤维的空间结构中，从而改善WHC。另外，玉米皮膳食纤维还具有良好的持油性（OHC）和胆固醇吸附性（见表5），对猪油（3.47±0.19 g/g）的吸附效果明显优于玉米油（2.59±0.01 g/g）、菜籽油（2.53±0.06 g/g）和大豆油（1.80±0.04 g/g），且胆固醇吸附性在 pH=2（胃环境 0.63±0.03 mg/g）优于 pH=7（肠道环境 0.31±0.02 mg/g），可以预防和治疗肥胖等疾病。

表5 玉米皮膳食纤维含量及理化性质Table 5 Corn bran dietary fiber content and physicochemical properties

玉米皮膳食纤维对不同浓度葡萄糖均具有良好的吸附性，葡萄糖吸附性随葡萄糖浓度增大而增大，由0.63 mmol/g逐渐增长至6.55 mmol/g，如图4（A）所示。通过测定不同时间下玉米皮膳食纤维对体外脂肪消化模型的影响发现，当乳化剂中不存在玉米皮膳食纤维时，120 min后乳化剂被完全消化。然而，在玉米皮食纤维存在的情况下脂质消化的速率和程度明显降低，120 min后FFAs释放量为70.04%，如图4（B）所示。葡萄糖吸附性是膳食纤维重要功能指标之一，膳食纤维的葡萄糖吸附性（GAC）与葡萄糖代谢功能有关，膳食纤维能够在体内发酵产生短链脂肪酸，可以预防糖尿病。

图4 玉米皮膳食纤维功能性质Fig.4 Functional properties of corn bran dietary fiber

3 结论

本研究对玉米皮膳食纤维的酶法制备工艺进行了响应面优化和功能性质研究。最佳酶解工艺为：碱性蛋白酶添加量0.742%、pH为10、温度54 ℃、酶解 4 h；淀粉复合酶（淀粉酶:糖化酶=1:1（m/m））添加量 0.727%、pH为 6.76、温度 65 ℃、酶解 2 h所得玉米皮膳食纤维含量为86.65%±0.72%；玉米皮膳食纤维中以不溶性膳食纤维为主，其持水性为3.93±0.17 g/g，膨胀性为 3.70±0.20 mL/g，对大豆油、玉米油、菜籽油和猪油的持油性分别为1.80±0.04、2.59±0.01、2.53±0.06、3.47±0.19 g/g，胆固醇吸附性在胃环境下为0.63±0.03 mg/g、肠道环境为0.31±0.02 mg/g。玉米皮膳食纤维对不同浓度的葡萄糖溶液具有良好的吸附性，且具有较强的体外抑制脂肪消化能力，可能与其含有较高的不溶性膳食纤维含量有关。本研究对提高玉米皮综合利用，实现粮食加工副产物的提质增效具有重要的意义。