不同品种亚麻籽8种生物活性物质含量及其主成分分析

孙 强 王丽艳 荆瑞勇 郭永霞

(1. 黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319；2. 国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319)

亚麻籽为亚麻的种子又称胡麻籽，不仅富含脂肪、蛋白质、氨基酸、糖类和矿物质等多种营养成分[1-2]，另外还含有生育酚、木酚素、黄酮、氰化物、植物甾醇等生物活性物质[3]。其中木酚素能够诱导癌细胞凋亡[4]，具有抑制人体乳腺癌细胞生长、预防经期综合症、前列腺癌、骨质疏松等作用[5-6]。生育酚是一种重要的脂溶性抗氧化剂，能够保护低密度的脂蛋白免于脂质过氧化，进而保持组织器官的完整性[7-9]。另外生育酚能够抑制血小板增殖和血细胞粘附[10]，在一定程度上能够降低患帕金森、阿尔兹海默症和癌症等疾病的风险[11]。甾醇在抗菌、抗肿瘤和预防心血管疾病方面有一定的功效[12]。亚麻籽过去主要用来榨油，随着科学研究的不断深入，其营养保健功能越来越引起人们的重视[13]。

通过前人研究发现，不同国家或产地的亚麻籽中生物活性物质含量具有明显差异[14]，这可能是导致不同的亚麻籽油在改善人类代谢性疾病方面存在不同效果的原因之一[15-16]。在中国亚麻种植品种主要有陇亚、坝亚、宁亚、晋亚等系列品种，亚麻籽品种以及产地的不同可能是导致亚麻籽主要生物活性物质组分和丰度差异的主要原因之一[3]。而关于利用多种生物活性物质成分对不同品种亚麻籽进行分析研究目前鲜有报道。

研究拟以6个产地的12个亚麻籽品种为研究对象，测定亚麻籽中总酚酸、木酚素、黄酮、总氰化物、植物甾醇、生育酚含量以及体外抗氧化活性DPPH自由基清除能力和FRAP值8个活性成分，并对其进行主成分分析，以期为中国亚麻籽深加工提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

亚麻籽：6个产地、12个品种，具体信息见表1。

余品种由黑龙江省科学院大庆分院提供。

1.2 仪器与试剂

紫外—可见分光光度计：DU800型，美国Beckman Coulter公司；

气相色谱仪：Agilent 6890型，美国Agilent公司；

超声波清洗器：Elmasonic E120H型，德国Elma公司；

超高效液相色谱仪：UPLC型，美国Waters公司；

脂肪测定仪：SZC-101型，上海纤检仪器有限公司；

芦丁(R-5143)、1,1-二苯基-2-硝基苦肼(DPPH)：95%，美国Sigma公司；

2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：99%，美国Sigma公司；

γ-生育酚(T-1782)：96%，美国Sigma公司；

6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(Trolox)、5α-胆甾烷：97%，美国Sigma公司；

植物甾醇：95%，西安蓝天生物工程有限责任公司；

木酚素(SDG)：98%，上海同田生物技术有限公司。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 木酚素含量 参考Eliasson等[17]的液相色谱法，稍做修改。准确称取0.25 g脱脂亚麻籽粉，加入40%乙醇溶液5 mL，超声提取30 min，4 000×g离心20 min，重复提取3次，合并上清液。加入 0.3 mol/L 氢氧化钠溶液10 mL，超声波水解30 min。用3.0 mol/L硫酸溶液调节pH值至3～5，双蒸水定容至25 mL，经0.22 μm滤膜过滤后进样分析。

1.3.2 总酚酸含量 参考Koski等[18]的Folin-Ciocaileu比色法，稍加修改。取0.5 mL提取物加入25 mL比色管中，再加入 Folin-Ciocaileu试剂1 mL和饱和碳酸钠溶液(20 g/100 mL)3 mL，用双蒸水定容至25 mL，漩涡混匀后，避光静置1 h，765 nm处测定吸光度值。

1.3.3 黄酮含量 参考Kim等[19]的比色法，稍加修改。吸取1 mL提取物放入10 mL比色管中，分别加入 0.3 mL 的5%亚硝酸钠溶液和0.3 mL的10%硝酸铝溶液，混匀后静置5 min，用甲醇—水(V甲醇∶V水=1∶1)溶液定容，静置5 min，紫外可见分光光度计在 503 nm 处测定吸光度值。

1.3.4 植物甾醇含量 参考Azadmard-Damirchi等[20]的气相色谱法，稍加修改。精确称取0.03 g索氏抽提亚麻籽油放入10 mL具塞离心管内，再加入0.5 mg/mL 5α-胆甾烷150 μL和3 mL 的2 mol/L 氢氧化钠—乙醇溶液，旋涡混匀，于70 ℃恒温摇床加热15 min。待室温冷却后分别加入1.5 mL正己烷和2 mL双蒸水，旋涡提取 5 min后1 500×g离心10 min。重复提取3次，合并上清液，用N2吹干后再加入100 μL的Tri-Sil溶液，超声辅助衍生化30 min，N2吹干，复溶于1.5 mL的正己烷，进行气相色谱分析，用内标法进行定量。

1.3.5 总氰化物含量 按GB 7486—87执行。

1.3.6 生育酚含量 参考禹晓等[3]的液相色谱法，稍加修改，精确称取0.1 g亚麻籽油，分别加入1 mL的0.05 g/mL 维生素C溶液，无水乙醇5 mL和0.5 mL的14.26 mol/L氢氧化钾溶液，置于70 ℃恒温摇床上皂化30 min。冷却至室温后，加入双蒸水3 mL，正己烷—乙酸乙酯(V乙酸乙酯∶V正己烷=15∶85)溶液5 mL，旋涡提取5 min 后1 500×g离心15 min。重复提取3次后合并上清液，用N2吹干，复溶于100 μL乙腈—甲醇—乙酸乙酯溶液(V乙腈∶V甲醇∶V乙酸乙酯=60∶20∶20)中，3 500×g离心10 min，取上清液进样分析。

1.3.7 DPPH自由基清除能力 参考Szydlowska-Czerniak等[21]的方法，稍作修改。吸取0.5 mL提取物，加入2.5 mL 38.0 μg/mL的DPPH甲醇溶液，漩涡混匀，避光静置30 min后515 nm处测定吸光度值，以甲醇为空白对照。

1.3.8 总抗氧化能力 参考Szydlowska-Czerniak等[22]的方法，稍加修改。取提取物1.0 mL和温育后的FRAP工作液2 mL于10 mL比色管中，双蒸水定容10 mL后旋涡混匀，避光静置20 min后在593 nm处测定吸光度值。

1.4 数据处理及统计分析

1.4.1 隶属函数值

(1)

式中：

U(Xj)——第j个综合指标的隶属函数值；

Xj——第j个综合指标，j=1，2，…，n；

Xmin、Xmax——第j个综合指标的最小值与最大值[23]。

1.4.2 权重

(2)

式中：

Wj——第j个综合指标的权重；

Rj——第j个综合指标的贡献率[24]。

1.4.3 综合评价值

(3)

式中：

D——不同品种亚麻籽的综合评价值[25]。

1.4.4 数据统计及分析

(1) 数据统计与整理：采用Excel 2013统计软件；差异性分析、相关性分析和主成分分析(PCA)采用R语言，自编程序。

(2) 聚类分析：采用SPSS 20.0数据分析软件，采用分析中分类下的系统聚类分析。

2 结果与分析

2.1 生物活性物质测定与分析

由表2可知，不同品种亚麻籽所含木酚素的差异最大，含量为281.35～931.33 mg/100 g；总酚酸含量为278.32～467.43 mg/100 g；黄酮含量为34.01～68.03 mg/100 g，与Oomah等[26]报道的研究结果基本一致(35～71 mg/100 g)；植物甾醇含量为351.21～601.37 mg/100 g；总氰化物含量为6.34～12.06 mg/100 g；生育酚含量为8.86～17.62 mg/100 g；12个品种亚麻籽提取物体外抗氧化活性也有一定的差异，DPPH自由基清除率为5 031.26～8 155.29 μmol Trolox/100 g，低于美国的亚麻籽抗氧化活性(12 000 μmol Trolox/100 g)[27]；FRAP值为8 342.67～14 864.39 μmol Trolox/100 g。8种生物活性物质最大值与最小值之间均存在显著性差异。8种生物活性物质的变异系数不同，木酚素的变异系数最大为41.55%，说明亚麻籽品种对木酚素含量影响最大，DPPH自由基清除率的变异系数最小为13.07%，说明亚麻籽品种对DPPH自由基清除率的影响最小，通过变异系数大小可知，不同亚麻籽品种对8种生物活性物质的影响顺序为木酚素含量>总氰化物含量>黄酮含量>植物甾醇含量>总酚酸含量>生育酸含量>FRAP值>DPPH自由基清除率。

表2 8种生物活性物质分析†

2.2 生物活性物质之间的相关性分析

由表3可知，木酚素含量与总酚酸含量、黄酮含量之间的相关系数为0.581和0.681，呈显著正相关；黄酮含量与总酚酸含量的相关系数为0.753，呈极显著正相关；植物甾醇含量与黄酮含量的相关系数为-0.712，呈极显著负相关；黄酮含量与DPPH自由基清除率、FRAP值的相关系数为0.712，0.827，呈极显著正相关；DPPH自由基清除率与FRAP值的相关系数为0.754，呈极显著正相关。其余各物质之间呈现不同程度的相关性，相关性均不显著。

表3 生物活性物质之间的相关性†

2.3 主成分分析

2.3.1 主成分提取 以8种生物活性物质和12个亚麻籽品种构成8×12矩阵，利用R语言对其进行主成分分析，结果见图1和表4。由表4可知，前3个主成分对应的特征值大于1，其方差贡献率分别为51.270%，18.685%，12.970%，由此可见第1主成分起到了主要作用，累计方差贡献率达到82.925%。故可提取出3个主成分，3个主成分定义为PCA,1、PCA,2、PCA,3，由表5可知其对应特征向量分别为：

PCA,1=0.333x1+0.378x2+0.480x3-0.335x4-0.247x5+0.020x6+0.398x7+0.428x8，

(4)

PCA,2=0.530x1-0.071x2+0.349x4+0.039x5-0.760x6+0.070x7-0.084x8，

(5)

PCA,3=0.249x1+0.463x2+0.074x3+0.149x4+0.790x5+0.227x6-0.135x7+0.004x8。

(6)

由图1、表4和表5可知，PCA,1的方差贡献率为51.270%，在PCA,1的表达式中，黄酮含量(x3)和FRAP值(x8)的系数较大，分别为0.480和0.428，可知PCA,1主要由黄酮含量和FRAP值决定；PCA,2的方差贡献率为18.685%，在PCA,2的表达式中，木酚素含量(x1)和生育酚含量(x6)系数较大，分别为0.530和0.760，可知PCA,2主要由木酚素和生育酚含量决定；PCA,3的方差贡献率为12.970%，在PCA,3的表达式中，总氰化物(x5)含量和总酚酸(x2)含量系数较大，分别为0.790和0.463，可知PCA,3主要由总氰化物和总酚酸含量决定。

图1 主成分图

表4 主成分的特征值、贡献率和累计贡献率

表5 主成分的特征向量与载荷矩阵†

2.3.2 亚麻籽基于生物活性物质的综合评价

(1) 隶属函数分析：根据式(1)可计算出每个品种亚麻籽综合指标(即主成分)的隶属函数值(表6)。从表6可知，对PCA,1而言，陇亚8的U(X1)值最大为 1.000，说明陇亚8在PCA,1上评分最高，而伊亚4的U(X1)值最小为 0，说明伊亚4在PCA,1上评分最低；对PCA2而言，坝亚11的U(X2)值最大为 1.000，说明坝亚11在PCA,2上评分最高，而陇亚8的U(X2)值最小为 0，说明陇亚8在PCA2上评分最低；对PCA,3而言，伊亚4的U(X3)值最大为1.000，说明伊亚4在PCA,3上评分最高，而伊亚3的U(X3)值最小为 0，说明伊亚3在PCA,3上评分最低。

(2) 权重的确定：根据3个主成分贡献率的大小，PCA,1

的贡献率为51.270%，PCA,2的贡献率为18.685%，PCA,3的贡献率为12.970%，可用式(2)计算出各主成分的权重，3个主成分的权重分别为0.618，0.225，0.156(表6)。

表6 综合指标值、权重、隶属函数值、D值及品质排序

(3) 综合评价：根据式(3)计算出综合评价值即D值的大小(表6)，根据D值对12个亚麻籽品种进行排序，其顺序为：坝亚11>宁亚17>坝亚9>陇亚8>轮选2>陇亚10>宁亚16>晋亚7>轮选1>晋亚8>伊亚3>伊亚4。

2.3.3 聚类分析 采用组间联接法对表6中的D值进行聚类分析，建立了聚类树状图(图2)，从图中可以看出聚类分析将其划分为三大类，其综合评价值依次降低。第I类包括坝亚11、宁亚17、坝亚9、陇亚8和轮选2；第II类包括陇亚10、宁亚16和晋亚7；第Ⅲ类包括轮选1、晋亚8、伊亚3和伊亚4。

图2 聚类树状图

3 结论

亚麻品种对亚麻籽内的生物活性物质有一定的影响，主成分分析得出第一主成分主要由黄酮含量和FRAP值决定，第二主成分主要由木酚素含量和生育酚含量决定，第三主成分主要由总氰化物含量和总酚酸含量决定，综合评分坝亚11最高，具有较高的营养保健价值，聚类分析12个亚麻籽品种可划分为三大类。该结论仅针对以上的8种生物活性物质得出的，有关亚麻籽内其他生物活性物质还有待进一步研究。