表面增强拉曼光谱法筛查保健酒中那非类药物
2022-10-24胡家勇周陶鸿姚晓帆袁敏文
胡家勇 周陶鸿 姚晓帆 袁敏文 柳 迪
(1. 湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430075；2. 国家市场监管重点实验室，湖北 武汉 430075；3. 湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北 武汉 430075；4. 黄石市食品药品检验检测中心，湖北 黄石 435000)
保健酒是指具有特定保健功能的酒，即适宜于特定人群饮用，具有调节机体功能，不以治疗为目的的酒[1]。保健酒主要以保健、养生、健体为目的，但为增加保健酒的壮阳效果，不法商贩会在酒中非法添加了西地那非(俗称“伟哥”药品成分)等化学成分。那非类药物具有一定毒副作用，若长期饮用添加“伟哥”的“保健酒”，会导致机体内分泌失调、头痛、昏厥、狂躁，引起心血管功能紊乱和呼吸功能衰竭，甚至导致死亡[2]。目前对于保健酒中那非类药物的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[3-5]、高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS)[6-9]、HPLC-MS/MS[10-11]和薄层色谱法[12]等，此外，免疫法[13]、 红外[14-15]及离子迁移谱法[16]等都被尝试用于保健食品中西地那非类药物的测定。目前国标检验方法[17-18]采用的是HPLC-MS，该方法在检测的灵敏度、选择性和高通量方面优势显著，但是存在检测周期长、仪器昂贵、检验费用高等缺点。目前关于保健食品中那非类药物的检验(无论是色谱法、质谱法，还是拉曼光谱法[19-21])都是针对已知目标物的靶向检测(HPLC-MS方法亦属于靶向检验)。鉴于食品中非法添加的那非类药物种类高达90种，并且还在不断更新，亟需建立一种非靶向检测技术以实现保健食品中非法添加那非类药物的快速筛查。
研究拟利用表面增强拉曼光谱技术建立那非类药物谱图库以及配套的数据库检索方式，将采集的光谱图导入到非靶向筛查数据库，实现非法添加物的快速初步筛查，以期为食品非法添加物检测提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
金纳米溶胶：普拉瑞思科学仪器(苏州)有限公司；
乙酸乙酯、氯金酸、柠檬酸三钠、硫酸、氯化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；
西地那非、他达那非、脱硫伐地那非、庆地那非、那非乙酰酸、苯酰胺那非等78种那非类标准物质(见表1)：纯度≥98%，中国药品生物制品研究所；
拉曼光谱仪：inVia型，英国Renishaw公司；
紫外分光光度计：UH5300型，日立公司；
扫描电镜：Quanta650 FEG，美国FEI公司。
表1 78种那非类药物标准物质信息
续表1
1.2 方法
1.2.1 SERS基底制备 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金[22]。根据氯金酸和柠檬酸三钠溶液的不同配比(见表2)，制备不同粒径的胶体金粒子。制备完成后胶体金粒子在200～800 nm波段进行紫外光谱扫描。
表2 胶体金制备
1.2.2 标准溶液配制 用甲醇分别将78种那非类物质的标准品配制成100 mg/L的标准溶液，-18 ℃下避光保存。使用前需恢复至室温。
1.2.3 样品前处理 吸取1 mL试样于15 mL离心管中，向离心管中加入4 mL乙酸乙酯，振荡涡旋5 min后3 000 r/min 离心5 min，收集上层有机相并定容至5 mL，上层有机相为提取液A。吸取1 mL提取液A于10 mL离心管中，加入4 mL 0.3 mol/L硫酸溶液，振荡涡旋5 min 后3 000 r/min离心5 min，收集下层溶液并定容至5 mL，下层溶液为提取液B。依次向检测瓶中加入500 μL 纳米金溶胶，100 μL提取液B，100 μL 1%的氯化钠溶液，混匀后上机检测。
1.2.4 拉曼光谱仪测定条件 曝光时间1 s，激光功率100 mW，扫描次数1次，物镜倍数50 L，激光波长785 nm，光栅1 200 L/mm，扫描范围650～1 700 cm-1。
1.3 数据统计分析
采用OMIC软件进行数据库的构建，用Python软件对数据进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 胶体金表征
2.1.1 不同粒径胶体金目测评价及紫外光谱表征 当1%柠檬酸三钠加入量为2.0 mL(1号)和1.5 mL(2号)时，所得到的胶体金呈酒红色，此时的胶体金粒径较小，视觉良好透明度高，无悬浮颗粒出现；当加入量为1.0 mL(3号)和0.7 mL(4号)时，胶体金呈现深红色；当加入量为0.5 mL(5号)和0.4 mL(6号)时，呈砖红色，且胶体金透明度较低，有明显肉眼可见的颗粒悬浮物。其中5号、6号放置一段时间出现了聚沉现象，稳定性差，而1号、2号、3号、4号金纳米溶胶未出现此现象，溶胶稳定性较好。
由图1可知，6组纳米金溶胶均有明显的吸收峰，每组的最大吸光值不同，1～3号纳米金胶体的最大吸光度逐渐增大，4～6号的最大吸光度逐渐减小。随着柠檬酸三钠添加量逐渐减少，最大吸收峰发生了明显的红移现象，因此，纳米金的最大吸收峰随其粒径的增大而发生红移，与文献[23]研究结果一致。
图1 不同粒径胶体金紫外吸收光谱
2.1.2 金纳米溶胶灵敏度性能评价 基底的灵敏度是评估基底是否合适的关键指标，其中，基底的灵敏度通常由增强因子[24](EF)表示，增强因子数学表达式为：
(1)
式中：
Eλ——增强因子；
ISERS——分析物的SERS光谱中选定的特征峰的强度；
IR——分析物的常规Raman光谱中选定的特征峰的强度；
NSERS——SERS光谱采集的被分析物分子的相应数量；
NR——常规Raman光谱采集的被分析物分子的相应数量。
选取西地那非作为目标物进行灵敏度试验。
对于金溶胶溶液拉曼增强基底，SERS探测和普通拉曼探测时的有效散射体积可认为相同，此时SERS增强因子按式(2)[25]计算：
(2)
式中
Eλ——增强因子；
ISERS——分析物的SERS光谱中选定的特征峰的强度；
IR——分析物的常规Raman光谱中选定的特征峰的强度；
CR——普通拉曼光谱探测时溶液质量浓度，mg/L；
CSERS——SERS光谱探测时溶液质量浓度,mg/L。
1～6号金纳米溶胶增强因子分别为2×103，6×103，8×105，1.2×106，1.5×105，4×103，其中4号金纳米溶胶增强因子最高。结合目测评价、紫外光谱表征以及灵敏度性能评价对1～6号不同金纳米溶胶进行综合评价，最终结果显示4号金纳米溶胶性能最佳，因此胶体金制备方式为：在98.3 mL超纯水中加入1.0 mL 1%氯金酸和0.7 mL 1%柠檬酸三钠。
2.1.3 金纳米溶胶SEM表征 图2是4号金纳米溶胶的SEM图。由图2可知，4号金纳米溶胶粒子分布均匀，形状较为规则，粒径范围为70～114 nm。
2.2 光谱数据的预处理
在拉曼光谱测试中，荧光是影响拉曼光谱分析的主要因素之一。利用WIRE 5.0拉曼光谱分析软件并使用荧光校正+基线校正+一阶导数的方法对光谱进行预处理。
图2 金纳米溶胶的SEM图
2.3 自建数据库
按照拉曼光谱仪的测定方式测定78种那非类药物，获取拉曼光谱图，并将SPC格式的文件导入OMIC软件中，同时备注化学药物的名称、CAS号，构建非靶向筛查数据库。
2.4 数据库的检索
样品经1.2.3的前处理方式处理后在650～1 700 cm-1扫描范围的模式下采集光谱，将采集的光谱图导入到非靶向筛查数据库进行检索筛查，检索结果中匹配度高于70%的样品被认为是疑似添加了那非类药物[26]。
2.5 非法添加物归属分析
为了能够确定检索出来的疑似物的类别归属及母核结构，研究基于78种那非类药物的拉曼光谱信息数据，通过Python软件对78种那非类药物进行聚类分析，将78种那非类药物分为了4种，定义为西地那非类、他达那非类、硫代西地那非类、伐地那非类。结合2.3的自建数据库进行那非类疑似药物的筛查及疑似物的母核结构预测。具体分类归属见表3。
表3 78种那非类药物分类
2.6 筛查方法最低检出质量浓度
选取4类那非类药物中具有代表性(结构与母核结构最接近)的化合物进行方法的最低检出质量浓度研究，选取的化合物分别为西地那非、他达那非、硫代西地那非、乙酰伐地那非，其对应的最低检出质量浓度见表4。
表4 代表化合物最低检出质量浓度
选取西地那非进行最低检出质量浓度确定，结果见图3。空白仅有试剂的SERS峰出现，而0.05，0.1，0.2 mg/L均出现了西地那非SERS特征光谱图，由此确定其最低检出质量浓度为0.05 mg/L。其他化合物的最低检出质量浓度同法确定。
图3 最低检出质量浓度光谱图
2.7 方法特异性考察
选取40个保健酒阴性样品，其中10个样品添加78种那非类标准物质，10个样品添加建库之外的那非类标准物质(那莫西地那非、羟基豪莫西地那非、羟基硫代豪莫西地那非、去乙基巴地那非、伐地那非乙酰基类似物、丙氧苯基异丁基艾地那非、他达那非二氯代杂质、二硫代去乙基卡巴地那非)，构建20个质量浓度为50 mg/L的模拟阳性样本。另外20个作为阴性样品，随机编号为1#～40#，按照1.2中样品前处理方法对40批次样品进行前处理后上机检测。由表5可知，样品未出现假阳性及假阴性结果，根据匹配度定性类别归属即能判定其母核结构。
表5 模拟阳性样品中那非类药物筛查
续表5
3 结论
(1) 基于SERS技术构建了保健酒中可能非法添加那非类药物的拉曼光谱谱图库以及配套的数据库检索方式，建立了保健酒中非法添加那非类药物非靶向筛查技术。
(3) 对于SERS基底的性能评价采取目测评价、紫外光谱表征以及灵敏度测试。结果表明，那非类药物胶体金SERS基底最佳制备方式为98.3 mL超纯水中加入1.0 mL 1%氯金酸和0.7 mL 1%柠檬酸三钠。关于那非类药物数据库的建立及检索是基于OMIC软件，以匹配度是否高于70%作为评判是否疑似添加那非类化学药品的依据。
(3) 为了更深层次地弄清非法添加那非类药物的归属，试验基于Python软件对78种那非类药物进行了聚类分析，最后选取4类那非类药物中具有代表性的化合物进行方法的最低检出质量浓度研究，结果：西地那非0.05 mg/L、他达那非0.5 mg/L、硫代西地那非0.05 mg/L、乙酰伐地那非0.1 mg/L。通过模拟实际样品对方法进行特异性考察试验，结果未出现假阳性及假阴性，说明建立的非靶向筛查技术能有效的筛查出保健酒中的那非类非法添加物。
