白藜芦醇通过下调CD44表达抑制胶质瘤U251细胞增殖和侵袭

张 亮 王凤鹿 李小强 王林林 陈 鹏 蒋小兵 赵海康

胶质瘤是发病率非常高的原发性脑肿瘤，恶性胶质瘤占一半以上[1]，预后非常差，即使选择手术进行最大限度切除及联合放化疗治疗，仍难以提高恶性胶质瘤的预后[2]，中位生存期只有15 个月左右[3]。白藜芦醇是一种天然多酚，对肿瘤细胞的发生、发展具有显著的抑制作用[4]。CD44 是一种跨膜蛋白，定位于细胞膜，参与细胞迁移、细胞粘附以及细胞间相互作用等，其表达异常与肿瘤恶化具有密切联系[5]。本文探讨白藜芦醇对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响及CD44在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料U251 细胞购自上海一研生物科技有限公司；胎牛血清和RPMI1640细胞培养基购自美国Gibco公司；白藜芦醇购自上海源叶生物科技有限公司；Lipofectamine2000TM 脂质体购自美国Invitrogen公司；RNA提取试剂盒及逆转录试剂盒购自日本Takara公司；广州锐博生物科技有限公司合成引物；Transwell 小室购自美国Coming-Costar 公司；细胞计数试剂盒（CCK-8）购自日本Dojindo公司，CD44、Cyclin D1、CDK4、MMP2、MMP9、GAPDH抗体购自英国Abcam公司，二抗购自美国ThermoFisher Scientific公司；引物和siCD44（GGACCUCUUUCAAUGACAATT）购自生工（上海）生物公司。

1.2 细胞培养 将U251 细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养48 h，待细胞生长密度接近90%时，利用胰蛋白酶消化细胞，制备单细胞悬液。收集细胞待用。

1.3 白藜芦醇干预 将单细胞悬液接种96孔板，每孔100 μl，加入白藜芦醇，浓度分别为0 μmol/L（空白对照组）、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L，培养48 h 进行细胞增殖和侵袭检测，根据结果选择最佳浓度进行CD44干预实验。

1.4 细胞转染 将U251细胞悬液接种6孔板，密度5×104个/孔。参 考Lipofectamine2000TM 说 明 书，将pcDNA3.1/CD44（CD44 过表达）、pcDNA3.1（过表达对照）等质粒转染胶质瘤U251 细胞，培养24 h 进行后续实验。

1.5 细胞增殖实验 将U251 细胞接种96 孔板，按照操作说明书，每孔加入10 μl CCK-8溶液继续孵育2 h，然后用酶标仪检测490 nm吸光值。

1.6 细胞侵袭实验 将基质胶涂布于侵袭小室上室，U251 细胞接种于下室，正常培养24 h，去除上室中的培养液，擦除未发生侵袭的胶质瘤细胞，利用0.1%浓度的结晶紫染色试剂进行处理，显微镜下拍照记录实验结果，记录视野下发生侵袭的细胞数量。

1.7 实时定量PCR 检测mRNA 表达 收集培养的U251 细胞，利用Trizol 试剂盒根据说明书提取细胞总RNA，利用反转录试剂盒根据说明书合成cDNA，利用RT-PCR 试剂盒根据说明书检测mRNA。PCR条件：96 ℃、4 min，95 ℃、20 s，56 ℃、10 s，72 ℃、15 s，35 个循环。运用2-ΔΔCt法分析相对表达量。引物序列见表1。

表1 PCR检测引物序列

1.8 免疫印迹法检测蛋白表达 收集待检测胶质瘤细胞，利用细胞裂解液将细胞完全裂解，12 000 转/min、4 ℃条件下离心15 min，收集上清液，利用BCA方法测定蛋白液浓度。利用SDS-PAGE电泳分离目的蛋白并转膜，脱脂奶粉4 ℃封闭过夜。加入一抗（1:1 000）常温孵育1 h，再加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG二抗常温孵育1 h（1:10 000），ECL试剂盒显影定影，拍照并记录。内参蛋白为GAPDH。

1.9 统计学分析 利用SPSS 20.0软件处理；定量资料以±s表示，采用单因素方差分析和t检验；P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇对U251 细胞增殖及侵袭的影响 与空白对照组相比，白藜芦醇明显抑制U251细胞的增殖和侵袭能力（P＜0.05；图1、2），而且呈浓度依赖性（P＜0.05；图1、2）。所以，用150 μmol/L 白藜芦醇进行CD44干预实验。

图1 白藜芦醇对U251细胞增殖能力的影响

2.2 白藜芦醇对U251 细胞CD44 表达的影响 与空白对照组相比，白藜芦醇明显抑制U251 细胞CD44 mRNA 和蛋白表达（P＜0.05；图3），而且呈浓度依赖性（P＜0.05；图3）。

图3 白藜芦醇对U251细胞CD44表达的影响

2.3 白藜芦醇对U251 细胞增殖和侵袭相关信号通路蛋白表达的影响 与空白对照组相比，白藜芦醇明显抑制U251 细胞增殖相关信号通路（Cyclin D1、CDK4）以及细胞侵袭相关信号通路（MMP2、MMP9）mRNA 和蛋白表达（P＜0.01；图4），而且呈浓度依赖性（P＜0.05；图4）。

图4 白藜芦醇对U251细胞增殖和侵袭相关信号通路蛋白表达的影响

2.4 CD44过表达对白藜芦醇作用的影响CD44过表达明显抑制白藜芦醇对胶质瘤U251 细胞增殖和侵袭的抑制作用（P＜0.05；图5）。

图5 CD44过表达对白藜芦醇作用的影响

3 讨论

图2 白藜芦醇对U251细胞侵袭能力的影响

白藜芦醇是一种植物抗毒素，在浆果、花生及葡萄等植物中广泛存在[6]。白藜芦醇对人体的心脑血管具有保护作用，同时具有神经保护、抗炎和抗氧化等作用[7]。Sun 等[8]研究显示，白藜芦醇显著增强皮肤鳞状细胞癌的治疗效果，参与调控皮肤鳞状细胞癌的发生发展过程。Subedi等[9]报道显示，白藜芦醇调控MAPK/PI3K 信号通路，抑制乳腺癌细胞增殖，同时明显促进细胞凋亡。Khusbu 等[10]研究显示，白藜芦醇显著抑制TRAF6的表达，从而抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。Yang等[11]研究显示，白藜芦醇抑制T98G 和U138 胶质瘤细胞Wnt2 和βcatenin的表达，从而抑制Wnt信号途径的活性，抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭。本研究发现，白藜芦醇显著下调CD44 表达，明显抑制胶质瘤U251 细胞的增殖和侵袭。CD44在细胞中具有两种作用，分别为淋巴细胞归巢受体和透明质酸受体，参与炎症、血管再生、细胞粘附以及肿瘤发生发展等[12]。Vanje 等[13]研究显示，釉母细胞瘤CD44 异常高表达，参与调控肿瘤细胞的发展过程。Guo等[14]报道显示，非小细胞肺癌CD44 表达异常升高，促进肿瘤细胞的增殖和迁移。本研究发现CD44 过表达可逆转白藜芦醇对脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用，表明CD44高表达对胶质瘤具有促进作用。Hu等[15]研究显示，CD44在乳腺癌细胞中高表达，参与调控肿瘤细胞的迁移和侵袭。Wang 等[16]研究显示，脑胶质瘤细胞CD44表达异常上调，并且CD44过表达促进脑胶质瘤细胞的增殖、侵袭及细胞干性发展。

此外，本研究结果显示白藜芦醇明显抑制胶质瘤U251 细胞CyclinD1、CDK4、MMP2、MMP9 等 表达。Zhang 等[17]研究显示，当细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK4 的表达降低时，细胞增殖受抑制。这提示白藜芦醇抑制胶质瘤U251细胞增殖，可能与下调CyclinD1、CDK4 的表达有关。Li 等[18]研究显示，胶质瘤细胞MMP2的表达水平下降时，细胞的增殖和侵袭能力也受显著影响。Dai等[19]研究显示，脑胶质瘤细胞MMP9 的表达水平下调时，细胞的增殖和侵袭能力显著下降，并且脑胶质瘤细胞的凋亡水平显著上升。另有研究表明，在人急性髓系白血病细胞中，CD44 活性下调时，细胞CyclinD1、CDK4 的表达水平下调，影响细胞的增殖[20]。此外，肾癌细胞CD44 表达上调，通过促进MMP2 和MMP9 调控肿瘤细胞的侵袭转移[21]。

综上所述，白藜芦醇明显抑制脑胶质瘤细胞的增殖和侵袭，其机制可能与下调CD44 的表达，进而抑制CyclinD1、CDK4、MMP2、MMP9的表达有关。