香合欢EST-SSR标记开发及种间通用性研究

安 琪， 冯源恒， 杨章旗*， 胡 拉

( 1. 广西师范大学 生命科学学院， 广西 桂林 541006； 2. 广西壮族自治区林业科学研究院广西马尾松工程技术研究中心， 南宁 530002 )

遗传多样性作为保护生物学研究的核心内容之一，是生物经长期进化的产物。群体遗传多样性研究对于评价一个群体对环境变化的适应能力，揭示该物种生物多样性和生态系统功能的维持机制及受威胁因素，对该物种种质资源有效保护相关策略的制定至关重要(孟艺宏等，2020)。香合欢()为豆科(Leguminosae)含羞草亚科(Mimosaceae)合欢属(Durazz)常绿大乔木，在我国福建、广东、广西、贵州、云南、四川、海南等省(区)均有分布(韦铄星等，2020)。香合欢具有生长迅速、出材率高、天然更新能力强等优点，是具有巨大发展潜力的高价值造林树种。此外，香合欢还具有极高的药用价值。以根入药，可用于治疗风湿关节痛、跌打损伤、创伤出血、疮癣、失眠等症状(蔡永敏，1996；蒋升湧，2003)。香合欢作为高经济价值树种，虽然自20世纪90年代起吸引了不少学者的目光，但大多集中在群落组成特征、药用价值探讨、培育栽培技术等方面，有关该树种种质资源的群体遗传学却研究较少，并缺乏可用的分子标记。

除香合欢外，合欢属及其近缘树种中有许多优质的用材树种，如合欢属的黄豆树()、金合欢属()的黑木相思()、南洋楹属()的南洋楹()、格木属()的格木()。对这些树种的相关研究同样集中在栽培技术、群落组成和分布特征、药用价值研究等方面，而群体遗传学方面却十分薄弱。目前，仅金合欢属公开发表过82对SSR引物，而合欢属、南洋楹属、格木属尚未有相关SSR引物的报道，从而限制了对各树种分子遗传方向的深入研究。若想开展各树种遗传多样性评价、比较基因组学、基因表达图谱的构建等分子遗传方面的研究，适宜分子标记的开发势在必行。简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)指由 1～6 个核苷酸为重复单元串联组成的长达几十个核苷酸的重复序列，也叫微卫星标记(microsatellite)(Tautz，1989)，因其数量丰富、遍布真核生物整个基因组、多态性高、重复性好、共显性遗传、特异性强等优点而被广泛应用于物种遗传多样性、遗传连锁图谱的构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究(Powell et al.，1996)。按其来源可分为基因组SSR(G-SSR)和表达序列标签SSR(EST-SSR)两类。其中，G-SSR标记基于基因组序列，其开发过程繁复、成本高、效率低；EST-SSR是基于表达序列标签开发微卫星的一种新型分子标记，除具有G-SSR标记的优点外，还具有序列保守性较高、在植物物种之间通用性的优点(张利达和唐克轩，2010；王丹丹和杨东霞，2017；Preethi et al., 2020)。鉴于此，本文基于香合欢转录组测序结果开发相关分子标记。

近年来，众多研究表明，SSR引物在物种及其近缘物种间，甚至在该物种与某些远缘物种间均具有一定的通用性(钟敏等，2012)。 张燕梅等(2020)发现剑麻EST-SSR引物在龙舌兰属、丝兰麻属和中美麻属中的通用性分别为68%、52% 和52%。张勇等(2019)发现66.67% 的桃EST-SSR引物在蔷薇科物种中扩增出多态性。方书生等(2018)发现棉花SSR标记在红麻中的通用性为53.5%。可见，在近缘物种间探讨EST-SSR引物的通用性有效且可行。本研究基于香合欢转录组测序结果设计开发EST-SSR引物，对其在香合欢、黄豆树、黑木相思、南洋楹、格木中的通用性进行研究，将现有引物转移到黄豆树、黑木相思、南洋楹、格木等近缘树种上，既可有效节约引物开发成本，提高引物的利用效率，也可为香合欢、黄豆树、黑木相思、南洋楹、格木及其他一些近缘物种的种质资源保护、遗传多样性等相关研究提供可靠分子标记。

1 材料与方法

1.1 材料

选取30份香合欢种质作为香合欢引物多态性研究的材料。另外，选取香合欢、黄豆树、黑木相思、南洋楹、格木种质资源各4份，作为引物通用性研究的材料(表1)。其中，格木和黑木相思材料均采自南宁市林业科学研究所，4份香合欢材料分别为广西百色市田东县地方种、广西百色市西林县地方种、海南省尖峰岭地方种、海南省霸王岭地方种，4份南洋楹材料中2份采自广东省林科院树木园、2份采自广西壮族自治区林业科学研究院，4份黄豆树材料采自广西壮族自治区林业科学研究院。格木、黑木相思、黄豆树材料由于取样地距离较近且取材较方便，因此采样后立即放入采样箱中，随后将样品放入-80 ℃冰箱进行保存；而香合欢和南洋楹材料因为取样地距离较远且取材较难，所以采集新鲜样品后立即放入硅胶中干燥保存。

表 1 50份供试材料的种质信息Table 1 Germplasm information of 50 tested materials

1.2 SSR标记开发

1.3 DNA提取

植物基因组DNA的提取是使用液氮将香合欢及其近缘物种的叶片研磨成粉末状，采用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取DNA， 使用微量分光光度计对提取好的DNA的浓度进行检测，置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 PCR扩增

PCR扩增反应总体积10 μL，含1 μL DNA(60 ng·μL)，0.2 μL dNTPs，上下游引物各0.25 μL，1 μL的10 × PCR Buffer，0.1 μL的Taq DNA Polymerase (5 U·μL)，7.2 μL的ddHO，扩增反应在PCR仪上进行。扩增程序为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性 15 s，58 ℃ 复变性 15 s，72 ℃ 延伸 30 s，25 个循环；72 ℃ 延伸 20 min，12 ℃保存。

1.5 扩增产物的检测

用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，在240 V恒压下电泳(一般为50～55 min)，可根据溴酚蓝指示剂的位置调整电泳时间。首先，将凝胶用dd HO清洗2次后，在固定液中固定10 min，随后取出凝胶用蒸馏水清洗2次，每次清洗2 min；然后，将凝胶放入0.15% AgNO溶液中染色6～7 min，用dd HO清洗2次，每次2 min，随后将凝胶放入显影液中至条带清晰，用dd HO清洗2次后读带并拍照。

1.6 数据统计与处理

用人工读带的方法读取条带，同一引物扩增产物中用A，B，C，…按条带长度从大到小进行编号，利用Popgene 1.32软件计算30份样品的遗传多样性指数。

计算所用SSR引物的(polymorphism information content)(杨国忠等，2004)。计算公式如下：

(1)

式中：为多态信息含量；和分别为第个和个等位基因频率；为等位基因数。

引物的有效扩增率为能够有效扩增的引物的数量与引物总数量的比值。

2 结果与分析

2.1 香合欢转录组中SSR重复单元类型

通过对香合欢9个样本进行RNA转录组测序获得33 335个SSR位点，对SSR的重复基元类型进行统计，发现主要有单核苷酸和二至六核苷酸等6种重复基元类型(表2)。其中，单核苷酸重复类型占SSR位点总数的64.73%，二核苷酸重复类型占SSR位点总数的20.64%，三核苷酸重复类型占SSR位点总数的12.30%，四至六核苷酸重复类型分别占SSR位点总数的1.62%、0.28%、0.42%。

自19世纪50年代吉林省开展滑雪运动以来，冰雪旅游的发展受到了政府的高度重视。根据《2016年吉林省旅游业发展报告》，截至2016年底，全省共有27所旅游院校，旅游培训师资队伍1375人，旅游院校在校学生6700人。旅游专业院校可以为冰雪旅游输送大量的服务和管理人才，但是冰雪旅游的发展还离不开专业的滑雪指导员和教练、专业的穿戴滑雪设备的研发设计人才和专业的冰雪规划和场地的建设人才。这些专业人才的缺乏，正是吉林省开展冰雪旅游的人力资源短板。

表 2 香合欢转录组中SSR重复单元的分布特征Table 2 Distribution of the SSR repeat motifs in Albizia odoratissima transcriptome

从表2可以看出，在单核苷酸重复类型中 T/A(45.07%)最多，A/T(44.73%)稍次之；二核苷酸重复类型中出现频率最高的为AT(16.97%)，其次是TA(14.34%)和AG/CT(12.42%)；三核苷酸重复类型中AAT/ATT(4.85%)出现的频率最高，GAA/TTC(4.59%)和TTC/GAA(4.24%)稍次之；四核苷酸重复类型中AAAT/ATTT(9.98%)出现的频率最高，其次为TTTA/TAAA(9.06%)。核苷酸重复类型一共有399种，除去单核苷酸重复类型的四种，二核苷酸重复类型、三核苷酸重复类型、四核苷酸重复类型、五核苷酸重复类型、六核苷酸重复类型分别有12、60、123、65、135种。

SSR的重复次数在5～68之间(表3)。其中，5～11次重复最多，占SSR位点总数的54.95%；12～18次重复排在第二位，占SSR位点总数的34.48%；19～25次重复占SSR位点总数的7.74%；重复次数高于25数量较少，仅占总位点数量的2.83%。在所有重复次数中，10次重复最多有5 792(17.38%)个，其次为11次重复和6次重复，分别有3 441个(10.32%)和2 926个(8.78%)。

表 3 SSR重复次数Table 3 SSR repetition times

2.2 香合欢EST-SSR引物的有效性

从表4可以看出，在243对香合欢EST-SSR引物中，有155对能够在香合欢中有效扩增。并且，不同核心重复类型的EST-SSR引物的有效扩增率有所不同，其中三核苷酸重复类型引物的扩增成功率(为66.34%)高于五核苷酸重复类型(为64.71%)和四核苷酸重复类型(为61.11%)的EST-SSR引物。

表 4 香合欢EST-SSR引物在5个树种中的扩增结果Table 4 Amplification results of EST-SSR primers of Albizia odoratissima in five tree species

2.3 SSR标记多态性信息

243对引物中，有37对能够在香合欢中扩增出多态性条带，多态性比率为23.87%。筛选出10对条带清晰、重复性好、多态性高的引物， 对30份香合欢种质进行鉴定，结果表明10对引物共扩增出26条条带(图1)，平均每对引物扩增出2.6条。使用Popgene 1.32 软件分析10对引物的多样性指数(表5)，其有效等位基因数的范围为1.149 7～2.455 7，平均值为1.816 4；Nei’s 基因多样性指数()的范围为 0.130 2～0.592 8，平均值为0.420 9；Shannon指数()的范围为 0.289 7～0.984 0，平均值为 0.677 1； 根据Botstein等 (1980)首次提出的>0.5 时，引物具有高度多态性；0.5<<0.25 时，引物具有中度多态性；<0.25 时，引物具有低度多态性。10对引物值的范围为 0.124 9～0.518 4，平均值为 0.351 7，除AO-130和AO-133为低度多态性引物外，其他均属于中高度多态性引物，表明所筛选引物可以用于香合欢种质遗传多样性分析和指纹图谱构建。

表 5 10对引物多态性信息Table 5 Information on polymorphism of 10 pairs of primers

1-30. 供试的30份香合欢材料。1-30. 30 tested materials. 图 1 利用引物AO-53 (A) 和AO-62 (B) 对30份香合欢种质扩增条带图Fig. 1 Amplification bands of 30 Albizia odoratissima germplasms using primers AO-53 (A) and AO-62 (B)

2.4 香合欢EST-SSR引物的通用性分析

由表4可知，在成功扩增的171对引物中，三核苷酸重复类型在黄豆树、南洋楹、黑木相思、格木中的有效扩增率分别为34.65%、42.57%、44.55%、15.84%；四核苷酸重复类型在黄豆树、南洋楹、黑木相思、格木中的有效扩增率分别为32.41%、44.44%、41.67%、12.04%；五核苷酸重复类型在黄豆树、南洋楹、黑木相思、格木中的有效扩增率分别为38.24%、52.94%、35.29%、20.59%。此外，五个树种均通用的引物有18对，香合欢、黄豆树、黑木相思、格木特异性标记分别有26对、8 对、5 对和1对，未发现南洋楹特异性标记。

有10对能够在黄豆树中扩增出多态性条带，多态性比率为12.20%，有10对能够在南洋楹中扩增出多态性条带，多态性比率为9.01%，有4对能够在黑木相思中扩增出多态性条带，多态性比率为3.96%，有1对能够在格木中扩增出多态性条带，多态性比率为2.78%。有2对引物能够在3个以上树种中扩增出多态性条带。部分引物在各树种的扩增结果见图2。

1-4. 黄豆树; 5-8. 格木; 9-12. 香合欢； 13-16. 南洋楹； 17-20. 黑木相思。1-4. Albizia procera; 5-8. Erythrophleum fordii; 9-12. Albizia odoratissima; 13-16. Falcataria falcata; 17-20. Acacia melanoxylon.图 2 引物AO-63 (A) 和引物AO-196 (B) 在不同树种的扩增条带图Fig. 2 Amplification bands of primers AO-63 (A) and AO-196 (B) in different tree species

香合欢EST-SSR引物在香合欢及其他树种的通用性比率三核苷酸重复类型引物平均为71.29%，四核苷酸重复类型引物平均为70.37%，五核苷酸重复类型引物平均为67.65%。可见，不同核心重复类型的香合欢EST-SSR引物的通用性有所不同，三核苷酸重复类型EST-SSR引物的通用性比率高于四核苷酸重复类型引物和五核苷酸重复类型引物。

3 讨论与结论

3.1 香合欢EST-SSR引物的通用性

在植物中三核苷酸重复类型的EST-SSR引物的通用性比率高于其他核心单元重复类型的引物(Chen et al., 2005; Li et al., 2008文明富等，2011；)。本研究中，三核苷酸重复类型的香合欢EST-SSR引物通用性比率(为71.29%)高于四核苷酸重复类型(为70.37%)和五核苷酸重复类型引物(为67.65%)，表明在香合欢中，三核苷酸重复类型EST-SSR引物的通用性也最高。

本研究对所设计的243对香合欢EST-SSR引物进行通用性筛选，发现有效扩增率为70.37%，这与Gao等(2003)，祁雅等(2004)和魏利斌等(2008)研究指出的，所设计EST-SSR引物的有效扩增率应在60%～90%之间相吻合。其原因可能有以下几个方面：一是实验中所用引物均根据二代测序结果所得，二代测序在拼接过程中可能会存在一些错误，导致引物设计不合理，因而不能有效扩增；二是根据转录组测序结果设计和筛选EST-SSR引物时，可能会出现所设计引物GC含量过高，形成二聚体或发卡结构等情况，从而影响聚合酶链式反应使引物不能扩增出有效的目的片段(钟敏等，2012)。

本研究发现在成功扩增出目的条带的171对引物中，有26对引物在其他4种树种中不具备通用性，这与钟敏等(2012)发现有216对引物仅在绿豆种中能够有效扩增的结果相似，其原因可能是这些EST-SSR位点为香合欢特有，这些香合欢特异性引物可为香合欢野生种或是近缘物种的分类和鉴别研究提供参考。

SSR引物的通用性与近缘分类群之间微卫星侧翼序列的保守性和进化过程中微卫星的稳定性息息相关。基因组编码区序列的保守性高于非编码区，EST-SSR来源于编码区序列，与功能基因相关，由于EST-SSR序列保守性较基因组SSR高，因此EST-SSR较基因组SSR的通用性高，且一般遗传距离越近的物种间引物的通用性越高(Liewlaksaneeyanawin et al., 2004；洑香香等，2011；文明富等，2011)。李春和孙晔(2012)发现124对中国板栗多态性EST-SSR引物在栲树中通用性和多态性分别为42.7%和56.6%。Feng等(2014)发现318对马尾松SSR引物分别有15对、10对和10对在湿地松、加勒比松、云南松中扩增出了多态性条带。徐杨等(2016)通过研究发现云南松EST-SSR引物在细叶云南松、马尾松、高山松、油松等近缘物种中具有较高的通用性。本研究中香合欢EST-SSR引物在各树种的通用性比率香合欢(63.79%)>南洋楹(45.68%)>黑木相思(41.56%)>黄豆树(33.75%)>格木(14.81%)。其原因可能是黄豆树、南洋楹和黑木相思同属于含羞草亚科(Mimosaceae)植物，而格木为苏木亚科(Caesalpinioideae)植物，黄豆树、南洋楹和黑木相思与香合欢之间的亲缘关系较格木更近，因而同源序列更多，扩增成功率相对更高。但是，在南洋楹和黑木相思中的通用性比率高于黄豆树，在一定程度上预示着香合欢与南洋楹、黑木相思的转录组信息更为近似，这与分类学上的亲缘关系远近并不完全一致，此种表型分类学与基因组学上的亲缘差异值得进一步深入探讨。由于本研究所设计引物数量有限，并未包含香合欢全部EST-SSR序列，可能会对引物通用性结果造成一定影响。为准确验证引物间的通用性规律，得到更加科学客观的结论，还需做大量研究，今后可在本研究的基础上采用更多引物在同种、同科、同属植物中进行广泛测试。

3.2 香合欢EST-SSR引物的多态性

一般来说，EST-SSR引物的多态信息含量的值会因物种、供试材料数量以及标记数目的变化而有所不同(魏利斌等，2008)。本研究发现，在香合欢中扩增出多态性条带的引物有37对(23.87%)，选用30份香合欢种质对10对多态性高、重复性好的SSR引物的多态性进行分析，平均每对引物扩增出多态性条带2.6条，仅引物AO-130和AO-133为低度多态性引物。其原因可能与本研究所用30份香合欢种质均为广西百色市隆林县地方种，材料间遗传背景差异较小且材料数量较少有关。在未来的工作中要加强对不同的地域、类型的香合欢种质的搜集和利用。此外，在黄豆树、南洋楹、黑木相思和格木中扩增出多态性条带的引物分别有10对(12.20%)、10对(9.01%)、4对(3.96%)、1对(2.78%)。本研究可基本满足香合欢、黄豆树、南洋楹的种质资源遗传多样性等研究需要，若想进一步分析香合欢引物在黑木相思和格木的多态性，可进一步增加筛选引物所用材料的数量，且最好选择不同省份或是不同国家来源的野生群体等差异较大的材料。

目前，对于香合欢、黄豆树、南洋楹、黑木相思、格木等豆科高经济价值、生态效益树种的基因信息的了解和研究还很缺乏，本研究获得的通用性引物将为继续深入开展香合欢遗传多样性与种质资源保护等研究提供帮助，也将进一步促进香合欢的一些近缘物种甚至一些远缘物种尤其是黄豆树、南洋楹、黑木相思、格木4个树种的种质资源的收集、保护、鉴定、遗传多样性分析等研究的开展。