不同前处理方式结合超高效液相色谱-串联质谱法测定当归中30种禁用农药残留量

2022-10-21朱仁愿刘国华蒲玉红

理化检验-化学分册 2022年10期

朱仁愿 ,陈婷 ,闫君 ,丁辉 ,刘国华 ,蒲玉红 ,李坚

(1.兰州市食品药品检验检测研究院甘肃省种植中药材外源性污染物监测工程研究中心,兰州 730050;2.兰州大学第二医院,兰州 730030)

当归是甘肃省的大宗道地药材,亦属药食同源物质,其药用历史悠久,具有补血活血、调经止痛、润肠通便之效,是常用的妇科病“圣药”[1]。现今,当归被广泛应用于食品、药品、保健品、化妆品等领域产品的生产加工,且出口至美国、日本、韩国等国家和地区。近年来,国内外关于中药质量安全的负面事件频繁曝光,以农药残留量超标为代表的外源性污染问题,严重威胁了民众的用药安全和中药国际贸易的可持续发展[2-3]。随着我国中医药事业的发展以及当归产业的深度开发研究,当归的需求量不断增加,因此保障其品质的安全性,既与人民饮食用药安全息息相关,也可提升国际市场竞争力。前处理是农药残留分析的重要环节,包括提取、净化两个过程,目的是在提取残留农药的同时,将油脂、色素、糖类、蛋白质、有机酸等会干扰检测结果的化学成分进行分离,以达到净化效果。目前,常用的前处理方式主要包括直接提取法、Qu ECh ERS法和固相萃取法[4]。试验发现,由于中药材本身含水量普遍较低,直接提取法在提取前未加入水或酸溶液浸泡,无法使植物细胞溶胀,糖类充分溶解,导致内吸性农药提取效率较低。因此,本工作采用Qu ECh ERS法和固相萃取法进行前处理,以超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)同时测定当归中30种禁用农药残留量,以期为控制当归质量提供数据参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity I-Class/Xevo TQD型超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪,配Mass Lynx 4.1工作站;AH 40型全自动均质器;Auto EVA-60型平行氮吹仪;5810R型离心机;IQ 7000型超纯水机;MS105DU型电子天平;RV 10型旋转蒸发仪;MS 3型涡旋混匀器;KS 501型振荡器。

混合对照品储备溶液:精密称取30种禁用农药对照品各10.00 mg,用甲醇溶解并转移至10 mL棕色容量瓶中,稀释至刻度,配制成1 g·L-1混合对照品储备溶液,密封,于-40℃冰箱中保存备用。

QuEChERS盐包:含无水硫酸镁6 g、无水乙酸钠1.5 g,货号5982-5755。

QuEChERS净化管:含无水硫酸镁900 mg、N-丙基乙二胺300 mg、C18吸附剂300 mg、硅胶300 mg、石墨化碳黑(GCB)90 mg,货号5610-2048。

Carb/NH2固相萃取柱:1 g·支-1,货号186003877。

30种禁用农药对照品的纯度均大于95.0%;甲醇、乙腈、甲酸、甲酸铵均为色谱纯;氯化钠、甲苯、冰乙酸均为分析纯;试验用水为超纯水。

23批当归药材均购自甘肃省定西市岷县,经兰州市食品药品检验检测研究院丁爱华副主任药师鉴定。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,3.5μm);柱温40℃;流动相A为含5 mmol·L-1甲酸铵的0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液,B为乙腈;流量0.3 mL·min-1;进样量2μL。梯度洗脱程序:0～1.0 min时,A为70%;1.0～12.0 min时,A由70%降至0,保持2.0 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,正离子模式扫描;多反应监测(MRM)模式;碰撞气为氩气(纯度99.999%);离子源温度150℃,干燥气温度500℃;干燥气流量900 L·h-1;毛细管电压4 kV。

30种禁用农药的其他质谱参数见表1,其中“*”为定量离子。

表1 30种禁用农药的质谱参数Tab.1 MS parameters of 30 banned pesticides

表1(续)

1.3 试验方法

1.3.1 Qu ECh ERS法

精密称取样品粉末3 g于50 mL离心管中,加入1%(体积分数,下同)冰乙酸溶液15 mL及1颗陶瓷均质子,涡旋2 min,静置30 min,再精密加入乙腈15 mL,涡旋2 min,以300次·min-1速率振荡10 min,加入QuEChERS盐包,立即摇散,以300次·min-1速率振荡3 min,冰浴中冷却10 min,以4 000 r·min-1速率离心5 min,分取上清液9 mL于Qu ECh ERS净化管中,涡旋1 min,以300次·min-1速率振荡10 min,以4 000 r·min-1速率离心5 min,精密吸取上清液5 mL,于40℃氮吹浓缩至近干,用60%(体积分数,下同)乙腈溶液稀释至1 mL,涡旋混匀,过0.22μm滤膜,取滤液待测。

1.3.2 固相萃取法

精密称取样品粉末3 g于50 mL离心管中,加入15 mL水及1颗陶瓷均质子,涡旋2 min,静置30 min,加入含1%冰乙酸的乙腈溶液30 mL和QuEChERS盐包,以300次·min-1速率振荡10 min,以4 000 r·min-1速率离心5 min,分取上清液10 mL,于40℃减压浓缩至约2 mL,装入经体积比3∶1的乙腈-甲苯混合溶液预活化的Carb/NH2固相萃取柱上,用体积比3∶1的乙腈-甲苯混合溶液30 mL洗脱,洗脱液于40℃减压浓缩至近干,用60%乙腈溶液稀释至1 mL,涡旋混匀,过0.22μm滤膜,取滤液待测。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

试验考察了Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)和Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,3.5μm)对30种农药分离效果的影响,结果见图1。

由图1可知:Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱上甲胺磷响应值高,但杀虫脒分离度差,硫环磷、氯磺隆等农药响应值低;Agilent ZORBAX SBC18色谱柱上各农药峰形良好,响应值和分离度均较佳。因此,试验选择以Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱分离各目标物[5]。

图1 不同色谱柱上30种禁用农药的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of 30 banned pesticides on different chromatographic columns

2.2 质谱条件的选择

用甲醇配制各农药的单标准溶液(20μg·L-1),通过软件自动优化和手动优化30种农药的质谱参数。Mass Lynx 4.1工作站的Target Ly Nxxs软件自动优化结果显示,杀虫脒、3-羟基克百威、甲拌磷、硫线磷、甲拌磷砜、苯线磷、苯线磷亚砜、治螟磷各有3对监测离子对,涕灭威砜、甲拌磷亚砜各有4对监测离子对,手动优化选取其中的2对监测离子对,其中丰度较强的一对作为定量离子对。优化后的质谱参数见表1。

2.3 稀释溶剂的选择

由于各农药极性和溶解度不同,导致其色谱行为差异较大。鉴于流动相以乙腈和水为主,试验比较了乙腈和体积分数分别为20%,60%,80%的乙腈溶液作为稀释溶剂时各农药的峰形。结果显示:乙腈的溶剂化效应明显,其作为稀释溶剂时,50%左右的农药峰形不好;当以20%乙腈溶液为稀释溶剂时,胺苯磺隆的溶解度不好;当以80%乙腈溶液为稀释溶剂时,保留时间小于1 min的农药易出现双峰,可能是由于稀释溶剂与流动相中有机相比例相差较大引起的;当以60%乙腈溶液为稀释溶剂时,各农药溶解度均较好,且双峰现象得到显著改善。因此,试验选择60%乙腈溶液作为混合对照品溶液和供试品溶液的稀释溶剂[6]。

2.4 基质效应

痕量分析中,基质效应(ME)会影响分析结果的准确度,一般采取基质匹配法和分析保护剂法来降低ME的影响。试验分别用阴性当归样品的基质匹配溶液和稀释溶剂稀释混合对照品储备溶液,使30种农药的质量浓度依次为10,25,50,75μg·L-1,以各农药在基质匹配溶液中与在稀释溶剂中的峰面积之比计算ME值。

结果显示:两种前处理方式下,涕灭威的ME值为1.30～1.93,其他农药的ME值为0.24～1.09,说明存在一定的ME。为降低ME的影响,试验采用基质匹配法绘制工作曲线[7]。

2.5 工作曲线和检出限

取适量的混合对照品储备溶液,用基质匹配溶液逐级稀释,配制成6个浓度水平的基质匹配混合标准溶液系列,按照仪器工作条件进行测定,以各农药质量浓度为横坐标,其对应的定量离子对峰面积为纵坐标绘制工作曲线,不同前处理方式下的线性参数见表2。

将最低浓度水平的基质匹配混合标准溶液进行稀释后进样,以不小于3倍信噪比确定检出限,结果见表2。

表2 线性参数和检出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

表2(续)

2.6 精密度试验

将2.5节中最高浓度水平的基质匹配混合标准溶液连续进样6次,计算定量离子对峰面积的相对标准偏差(RSD),结果显示QuEChERS法和固相萃取法下30种禁用农药测定值的RSD分别为1.4%～12%和1.0%～13%。

2.7 回收试验

按照试验方法对阴性当归样品进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定5次,计算回收率,结果见表3。

表3 回收试验结果Tab.3 Results of test for recovery

表3(续)

结果显示:30种禁用农药经Qu ECh ERS法和固相萃取法处理后的回收率分别为60.4%～140%和61.0%～144%,结果较为接近,且主要集中在80.0%～90.0%。GCB对磺隆类农药有较强的吸附性,所以甲磺隆、氯磺隆和胺苯磺隆经固相萃取法处理后的回收率均低于经QuEChERS法处理后的[8]。内吸磷的回收率在两种前处理方式下均偏高,因其有硫酮式(O)和硫醇式(S)两种异构体,液相色谱-质谱法不能做到完全分离,可考虑用气相色谱-质谱法进行验证确认。