QuEChERS净化-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定黑枸杞中46种农药残留量

刘志荣,刘东升,张明童,谢 楠,李冬华

(甘肃省药品检验研究院 甘肃省中藏药检验检测技术工程实验室国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室,兰州 730070)

黑枸杞富含蛋白质、多糖、氨基酸、维生素、微量元素、花青素等大量人体所需的营养物质,是一种营养丰富的膳食材料[1],不仅具有极高的食用价值,而且具有一定的保健医用价值。《晶珠本草》记载,黑枸杞果实对心脏病、月经不调、停经等疾病具有治疗作用。现代医学研究表明,黑枸杞中的花青素具有抗氧化活性[2]。目前,黑枸杞短缺的野生资源已经无法满足市场需求。随着人工种植的推广,黑枸杞中农药残留问题日益凸显,引起食用群体的广泛关注。国家标准GB 2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》规定了各种食品中常见农药的残留限量,但黑枸杞未收录其中,也没有相应的检测方法。另外,2020年版《中华人民共和国药典》四部通则0212和2341分别规定了33种禁用农药的检测方法和测定下限,但研究对象中也不含黑枸杞。因此,有必要建立黑枸杞中农药残留的分析方法。

黑枸杞中的化学成分复杂,农药残留分析容易受到基质的干扰,因此减少基质效应(ME),进行基质净化是黑枸杞中农药残留分析的关键。QuECh-ERS具有“绿色化学”以及操作简便的特点,在许多国家和地区的农业、食品、药品质量安全等领域应用,并得到农药残留分析者的广泛关注[3-5]。文献[6]用9种不同的QuEChERS吸附剂净化当归基质,采用超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLCMS/MS)考察了86种农药的回收率,结果发现无石墨化碳黑(GCB)的Qu ECh ERS吸附剂对当归基质的净化效果最佳。文献[7]改进QuEChERS吸附剂构成比例,结合UHPLC-MS/MS同时测定了甘草中86种农药残留量。文献[8]采用QuECh ERS净化白芷基质,以UHPLC-MS/MS同时测定了白芷中50种农药残留量。

本工作根据产地调研结果,选取了黑枸杞种植中经常使用的46种农药为检测指标,比较了不同组合的Qu ECh ERS吸附剂对黑枸杞基质的净化效果,结合UHPLC-MS/MS对黑枸杞中46种农药回收率进行考察,筛选出最有效的Qu ECh ERS吸附剂组合,并对12批黑枸杞样品中46种农药残留量进行测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1290-6400型超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪;BSA224S型电子天平;TG16-W型高速离心机。

混合标准溶液:取适量的46种农药标准品,用丙酮配制成100.0 mg·L-1混合标准溶液,于-20℃保存备用。

内标溶液:取适量的磷酸三苯酯标准品,用丙酮配制成100.0 mg·L-1内标溶液,于-20℃保存备用。

46种农药标准品的纯度均大于95%;磷酸三苯酯标准品的纯度为99%;丙酮、乙腈、甲醇均为色谱纯;试验用水为纯化水;N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)和GCB的粒径均为40μm。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Eclipse Plus C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm);柱温40℃;流动相A为含10 mmol·L-1甲酸铵的0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液,B为乙腈;流量0.3 mL·min-1;进样量5μL。梯度洗脱程序:0～0.2 min时,B为30%;0.2～10.0 min时,B由30%升至100%;10.0～11.0 min时,B由100%降至30%,保持3.0 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源,正、负离子扫描(ESI＋,ESI-);动态多反应监测模式;检测窗时间2 min;干燥气温度350℃,干燥气流量10 L·min-1;雾化器压力310.3 k Pa;鞘气温度300℃,鞘气流量10 L·min-1;毛细管电压4.5 kV(ESI＋),4.0 kV(ESI-);喷嘴电压500 V。其他质谱参数见表1。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

表1(续)

1.3 试验方法

黑枸杞样品冷冻干燥12 h,粉碎,过孔径(250±9.9)μm的筛网。称取5.00 g黑枸杞粉末至50 mL聚丙烯离心管中,精密加入100μg·L-1内标溶液15μL和水5 mL,涡旋混匀,浸泡10 min,使样品吸水完全溶胀。然后加入含1%(体积分数)乙酸的乙腈溶液10 mL,剧烈涡旋2 min,使样品完全浸润。接着加入无水硫酸镁4.0 g和氯化钠1.0 g于上述离心管中,立即摇散,防止结块,剧烈振荡3 min,以转速5 000 r·min-1离心5 min。将上清液全部转移至预先装有1.0 g无水硫酸镁的15 mL聚丙烯离心管中,剧烈振荡2 min,以转速5 000 r·min-1离心5 min。精密量取上清液2 mL于装有PSA 20 mg、C1820 mg和GCB 25 mg的5 mL聚丙烯离心管中,剧烈振荡2 min,以转速8 000 r·min-1离心5 min,取上清液待测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

根据课题组先前的工作[7,9],考察了不同流动相体系和梯度洗脱程序对46种农药分离效果的影响。结果表明:大多数农药在流动相体系为0.1%甲酸溶液-乙腈时的峰形较0.1%甲酸溶液-甲醇时的好,但是部分农药响应值较低;以含10 mmol·L-1甲酸铵的0.1%甲酸溶液-乙腈为流动相体系进行梯度洗脱时,46种农药分离效果较佳,大多数目标物色谱峰峰形较好,响应值较高。

2.2 质谱条件的优化

为了提高检测灵敏度,保证46种农药均具有较高的响应强度,选择以响应强度最低的甲基对硫磷为指标优化质谱条件。结果表明,当干燥气温度为350℃,鞘气温度为300℃时,甲基对硫磷的响应强度较高,此时对其他目标物的定量影响不大。优化后的其他质谱条件见1.2.2节,46种农药的总离子流色谱图见图1。

图1 46种农药的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of 46 pesticides

2.3 QuEChERS吸附剂的优化

试验考察了不同组合的Qu ECh ERS吸附剂(C1820 mg＋PSA 20 mg、C1820 mg＋PSA 20 mg＋GCB 10 mg、C1820 mg＋PSA 20 mg＋GCB 15 mg、C1820 mg＋PSA 20 mg＋GCB 25 mg、C1820 mg＋PSA 20 mg＋GCB 35 mg)对空白加标样品中46种农药的回收率和测定值的相对标准偏差(RSD,n＝6)的影响。

结果显示:当C18和PSA用量均为20 mg时,46种农药的回收率为45.4%～110%,测定值的RSD为3.2%～21%,回收率满足70.0%～120%要求的农药占43.5%,说明该组合Qu ECh ERS吸附剂的净化效果不佳,不能有效避免基质干扰。黑枸杞乙腈提取液呈紫黑色,色素含量较高,为有效去除这些色素,通过添加一定量的GCB,可达到减少色素干扰的目的。随着GCB用量的增加,46种农药的回收率范围逐渐缩窄;当GCB用量增加到25 mg时,回收率为47.5%～125%,测定值的RSD均小于17%,回收率在70.0%～120%内的农药增加至87.0%,此时大多数目标物不受基质干扰影响,净化效果较好。因此,试验选择以PSA 20 mg＋C1820 mg＋GCB 25 mg为QuEChERS吸附剂。

2.4 基质效应

在痕量分析中,ME对分析结果的准确度和精密度影响显著。为进一步研究Qu ECh ERS吸附剂减少ME的性能,以空白样品为基质,分别用溶剂乙腈、未经QuECh ERS净化的基质匹配溶液和经QuEChERS净化的基质匹配溶液配制质量浓度为5.0,10.0,20.0,50.0,100.0μg·L-1的混合标准溶液系列(其中内标质量浓度为15.0μg·L-1),按照仪器工作条件进行测定,根据公式(1)计算ME值[10],结果见表2。

式中:k1为溶剂标准曲线的斜率;k2为基质匹配溶液标准曲线的斜率。

由表2可看出,未净化的样品中46种农药的ME值为-98.2%～159%,净化后的ME值为-48.4%～39.5%,并且大部分目标物的ME值均在可接受范围内(-20%～20%)[9],说明所选的QuEChERS吸附剂可以较好地净化黑枸杞样品。

表2 ME值Tab.2 ME Values

2.5 标准曲线、检出限和测定下限

按照2.4节中的方法配制质量浓度为3.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,300.0μg·L-1的 经QuECh-ERS净化的基质匹配混合标准溶液系列(其中内标质量浓度为15.0μg·L-1),按照仪器工作条件进行分析。以各目标化合物的质量浓度为横坐标,对应的峰面积与内标峰面积比值为纵坐标绘制工作曲线。结果显示,46种农药工作曲线的线性范围为3.0～300.0μg·L-1(相 当 于6.0～600.0μg·kg-1),线性参数见表3。

分别以信噪比为3和10时对应的质量分数为检出限和测定下限,结果见表3。

表3 线性参数、检出限和测定下限Tab.3 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.6 精密度和回收试验

按照试验方法对空白样品进行3个浓度水平的加标回收试验,计算回收率和测定值的RSD,结果见表4。

表4(续)

由表4可知,46种农药的回收率为47.5%～129%,测定值的RSD为3.0%～17%,基本符合准确度和精密度的分析要求[11]。PSA中的氨基对黑枸杞基质中的酸性物质有较好的吸附效果,但同时也会吸附部分酸性农药,如甲胺磷、氧化乐果、地虫硫磷、治螟磷;并且GCB吸附色素干扰物的同时,也会吸附部分与GCB具有相似平面结构的农药,如多菌灵、地虫硫磷。因此,甲胺磷、氧化乐果、多菌灵、地虫硫磷和治螟磷的回收率较低。

2.7 样品分析

按照试验方法分析12批黑枸杞样品,每个样品重复分析两次,结果见表5。

表5 样品分析结果Tab.5 Analytical results of the samples μg·kg-1

结果显示,6批黑枸杞样品中共13种目标物被检出,其余目标物均未检出。参考GB 2763-2021,除克百威外,其余农药的检出量均低于残留限量。GB 2763-2021规定药用植物中克百威的残留限量为20μg·kg-1,样品S3中克百威检出量高于残留限量,表明黑枸杞存在克百威残留超标的安全隐患。

本工作通过优化QuECh ERS吸附剂配比,提出了UHPLC-MS/MS测定黑枸杞中46种农药残留量的方法。该方法回收率较高、精密度较好,为黑枸杞中多农药残留的测定提供了技术参考。