通过式固相萃取-气相色谱-三重四极杆串联质谱法同时测定淡水鱼中14种麻醉剂的残留量

赵 莹,尹丹阳,王 玮,胡佳薇

(陕西省疾病预防控制中心,西安 710054)

随着经济的快速发展和生活水平的逐渐提高,人们对水产品的需求已不仅仅停留在其种类上,同时对其质量和鲜活度也提出了更高的要求。为了使水产品保活保鲜,运输和暂养过程中开始广泛使用渔用麻醉剂来降低水产品的代谢强度、抑制应激反应,以减缓损伤,延长其存活时间。目前,在鲜活鱼类的流通环节中常使用的渔用麻醉剂有三卡因、普鲁卡因、利多卡因、丁香酚类化合物、二氧化碳、乙醚等。丁香酚类化合物属于天然提取的植物性香料,常作为食品添加剂或化妆品的定香剂。同时,该类化合物对鱼类有很强的麻醉作用,具有高效、价格低廉、在水产品体内代谢快的优点。虽然没有充分的试验数据证明丁香酚类化合物对人体具有致癌性,但毒理数据表明,其对肝细胞具有一定毒性,存在肝损伤的风险。普鲁卡因、利多卡因等常见的局部麻醉剂属于神经中枢阻滞药品,根据中间链的不同,又可分为以普鲁卡因为代表的苯甲酸酯类化合物和以利多卡因为代表的酰胺类化合物[1]。这些局部麻醉剂具有作用效果快、操作简单的优点,但是过量摄入可能会引起中枢神经系统毒性反应,如肌肉震颤、惊厥、昏迷、呼吸抑制等不良反应[2]。三卡因是目前应用最广的渔用麻醉剂,具有易溶于水、麻醉效果快、对水产品无毒害性的特点[3-4]。美国食品药品监督管理局(FDA)批准三卡因在指定水产品的运输中使用,但需经过21 d的停药期才能投放市场销售[5]。丙泊酚化学名为2,6-双异丙基苯酚,常作为临床静脉麻醉剂,具有麻醉诱导起效快、可控性强且功能恢复完善等优点,过量使用会导致心衰及肾衰等[6]。丙泊酚作为一种新型的渔用麻醉剂虽然没有被广泛应用,但已有文献报道其在水产品中被检出[7]。目前,大部分渔用麻醉剂的使用存在广泛争议,主要原因是麻醉剂残留对人体的风险危害还没有完全明确,且国内对各种麻醉剂的使用和残留限量尚无明确的政策法规[8],缺乏有效的监管和安全剂量的权威判定。

检测渔用麻醉剂的主要方法有高效液相色谱法[9-10]、液相色谱-串联质谱法[11-12]、气相色谱法[13]、气相色谱-串联质谱法[14-15]等。但检测对象局限于单一或有限种类,且方法检出限较高,未见水产品中多种麻醉剂同时检测的研究报道。本工作的检测对象兼顾了传统和新型麻醉剂,提出了气相色谱-三重四极杆串联质谱法(GC-MS/MS)同时测定淡水鱼中丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、顺式-甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酰基异丁香酚、丙泊酚、三卡因、苯佐卡因、利多卡因、普鲁卡因、普莫卡因、丁卡因和布他卡因等14种麻醉剂残留量的方法,以期为食用鱼类产品的麻醉剂质量安全监管提供检测参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

7890B-7000C型气相色谱-三重四极杆质谱联用仪;CPA225D型分析天平;TTL-DCⅡ型氮吹仪;SI-T256型涡旋振荡器;TG16-WS型高速离心机;SPE-24A型固相萃取装置。

混合标准储备溶液:准确称取适量的14种渔用麻醉剂标准品(精确至0.000 1 g),以甲醇为溶剂,配制成各自的单标准储备溶液,于4℃冰箱避光密封保存;分别吸取一定量的单标准储备溶液,用丙酮稀释,配制成质量浓度为100.0 mg·L-1的混合标准储备溶液,于4℃冰箱避光密封保存。使用时,用丙酮稀释至所需质量浓度。

内标溶液:准确称取5.0 mg丁香酚-d3标准品,用甲醇溶解后定容至10 mL,配制成500 mg·L-1内标储备溶液;再用丙酮稀释,配制成5.00 mg·L-1内标溶液,于4℃冰箱避光密封保存。

14种渔用麻醉剂标准品和丁香酚-d3标准品的纯度均不小于95%;其余试剂均为色谱纯;试验用水为去离子水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

HP-5MS UI毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);载气为高纯氦气,流量1.0 mL·min-1;进样口温度250℃;进样量1μL,不分流进样。柱升温程序:初始温度80℃;以6℃·min-1速率升温至170℃,保持1 min;再以50℃·min-1速率升温至220℃;最后以15℃·min-1速率升温至270℃,保持4 min。

1.2.2 质谱条件

电子轰击离子(EI)源;离子源温度230℃;离子化能量70 e V;溶剂延迟时间8 min;传输线温度280℃;碰撞气为高纯氮气,流量1.5 mL·min-1;猝灭气为高纯氦气,流量2.25 mL·min-1;多反应监测(MRM)模式,其他质谱参数见表1。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

将淡水鱼样品清洗干净,去除头、骨、内脏,取肌肉等可食部位绞碎,混合均匀,于-18℃以下冷冻保存,备用。准确称取混匀样品2 g(精确至0.000 1 g)于50 mL聚丙烯离心管中,加入5.00 mg·L-1内标溶液100μL和水5 mL,涡旋混匀,使样品完全浸润,静置30 min。精密加入乙腈10 mL,涡旋混匀,以500次·min-1速率剧烈振荡10 min后,加入氯化钠2 g盐析分层,以8 000 r·min-1转速离心10 min。取5 mL上清液加载到PRi ME HLB柱上,收集流出液。取2 mL流出液于10 mL离心管中,加入50μL二甲基亚砜(DMSO),常温下氮吹至近干,用1.0 mL丙酮复溶,振荡30 s,再用0.22μm微孔滤膜过滤,滤液供GCMS/MS测定。根据保留时间和特征离子对定性,内标法定量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

试验发现,进样口温度、进样方式等色谱条件对目标物的峰形和灵敏度都有较大影响,主要表现为:进样口温度过低,后出峰的丁卡因、普莫卡因和布他卡因等灵敏度降低;进样口温度过高,前出峰的丁香酚类目标物拖尾严重。当进样口温度为250℃,不分流进样时,各目标物的峰形尖锐、对称且柱流失较小,后出峰的丁卡因、普鲁卡因和布他卡因的灵敏度较高。

试验选用HP-5MS UI、INNO-WAX毛细管色谱柱对14种目标物的混合标准溶液进行比较分析。结果表明:INNO-WAX毛细管色谱柱对丙泊酚、甲基丁香酚的分离能力较差,三卡因、苯佐卡因的响应值较低,普莫卡因、布他卡因在该色谱柱上较难出峰;而HP-5MS UI毛细管色谱柱能够将14种目标物较好分离,且各组分的响应值较高。

综上分析,试验选择进样口温度为250℃,进样方式为不分流进样,选用HP-5MS UI毛细管色谱柱进行分离。MRM模式下混合标准溶液的总离子流色谱图如图1所示。

图1 混合标准溶液的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of the mixed standard solution

2.2 质谱条件的选择

在选定的色谱条件下,对14种目标物和内标进行单杆全扫描(MS1 Scan)分析,得到每种物质的总离子流色谱图。依次选择相对丰度较高的一级碎片为各目标物的前级离子。在同样的色谱条件下,选择产物离子(Product Ion)扫描模式,设定适宜的碰撞电压,使碰撞气对目标物的前级离子进行碰撞诱导解离,产生碎片离子,得到二级质谱图。依次选取3组丰度高且基质干扰小的碎片离子与前级离子组成定量和定性离子对,选择EI源和MRM模式,进一步优化碰撞能量,确保特征碎片离子产生的离子对强度达到最大。优化后的质谱参数见表1。

2.3 净化方法的选择

水产品基质复杂,需要对样品进行有效的净化,以去除脂质、蛋白质、糖类、有机酸等干扰物质,保证准确定量的同时避免色谱柱和离子源的污染。常用的净化方法主要有液液萃取法、分散固相萃取法和固相萃取法等。液液萃取法是将乙腈饱和的正己烷溶液直接加入到提取液中,利用目标物和杂质在两相中重新分配的原理对基质进行除脂净化。该方法能大大提高目标物的回收率,但是对样品中有机酸、糖类及其他极性较强的杂质去除效果不好,上机检测后杂质峰明显,对鱼类基质的净化效果不理想。分散固相萃取法是使用Qu ECh ERS萃取包净化样品。虽然QuECh ERS已不再局限于果蔬中农药残留的检测,但检测高脂肪和高油脂的动物性样品时,需要对现有的QuECh ERS进行改进。这是因为市售成品萃取包中普遍采用的石墨化碳黑(GCB)对油脂类杂质的净化效果差,且GCB的吸附性较强,目标物不易洗脱,所以在试验过程中需要根据待测样品和目标物的实际情况对C18吸附剂、N-丙基乙二胺(PSA)、GCB等吸附净化材料及其配比进行选择和优化。

常用的固相萃取法主要依靠硅胶柱、C18柱、HLB柱等实现样品的净化。使用硅胶柱等正相柱进行固相萃取时,需在提取之后置换弱极性溶剂上样,这不仅增加了前处理步骤,而且置换溶剂的氮吹过程易造成目标物(如丁香酚类化合物,沸点较低)的损失。使用C18柱和HLB柱等反向柱进行固相萃取时,需要活化、淋洗和洗脱等步骤,尤其C18柱不能干柱使用,在实际操作中更加繁琐。与之相比,同为反向柱的PRiME HLB柱更具优势,使用通过式处理的方式,无需活化和平衡,提取液直接上柱,杂质在柱上保留,目标物直接通过,被收集于流出液中,简化和加速了净化过程。因此,试验选择PRiME HLB柱净化样品。

2.4 提取溶剂的选择

提取液直接过柱后被收集,无需淋洗和洗脱条件的优化,因此提取溶剂既要保证目标物在提取步骤中的提取率,又要确保净化过程中目标物的回收率。常用80%(体积分数,下同)乙腈溶液提取传统水产品中的丁香酚类化合物[16]。在本方法中,为保证不同种类的麻醉剂过柱后均能获得较好的回收率,考察了以乙腈和体积分数分别为70%,80%,90%的乙腈溶液为提取溶剂时对各目标物回收率的影响,结果见图2。

图2 提取溶剂对14种麻醉剂回收率的影响Fig.2 Effect of the extract solvent on recovery of 14 anesthetics

结果表明:对于丁香酚类化合物,使用80%乙腈溶液的回收率比使用其他体积分数的乙腈溶液要高,但是其他种类目标物的回收率总体偏低;使用乙腈提取后,丁香酚类化合物的回收率虽然比使用80%乙腈溶液的偏低,但苯佐卡因、利多卡因、普莫卡因、普鲁卡因、丁卡因和布他卡因等麻醉剂的回收率均有显著提高,且14种麻醉剂的回收率均能达到85.0%以上,满足同时检测的需求。同时,用乙腈提取后,无需除水,更易氮吹浓缩,减少了后续步骤中目标物的损失。因此,试验选择的提取溶剂为乙腈。

样品经乙腈提取净化后,将乙腈置换成丙酮,便于上机检测。在使用常规的氮吹方法对净化液进行浓缩时,发现丁香酚类化合物因沸点低、易气化的原因,很容易造成损失,其回收率均小于60.0%,其中丁香酚和异丁香酚的回收率不足50.0%。为解决丁香酚类化合物损失问题,试验选择在净化液中加入微量的DMSO。由于DMSO的沸点高,能与大多数有机溶剂互溶,且对丁香酚类化合物的溶解性好,通过微量的加入,可使其保留在DMSO中,减少了加热氮吹过程中的气化损失,有效提高了目标物的回收率。

2.5 工作曲线、检出限和测定下限

选取阴性样品为空白基质,依次加入一定量的混合标准溶液和内标溶液,配制成各目标物质量浓度为0,0.005,0.010,0.020,0.040,0.060,0.080,0.100,0.200,0.400 mg·L-1,内标质量浓度为0.100 mg·L-1的基质匹配的混合标准溶液系列。按照仪器工作条件进行测定,以各目标物与内标的质量浓度比为横坐标,其对应的峰面积比为纵坐标绘制工作曲线。结果显示:14种麻醉剂工作曲线的线性范围为0.005～0.400 mg·L-1,线性回归方程和相关系数见表2。

表2 线性回归方程和相关系数Tab.2 Linear regression equations and correlation coefficients

采用逐级稀释空白基质加标溶液的方式,以信噪比(S/N)为3时对应的质量分数为检出限,以S/N为10时对应的质量分数为测定下限,结果得14种麻醉剂的检出限均为0.001 mg·kg-1,测定下限均为0.002 5 mg·kg-1。

2.6 精密度和回收试验

在空白基质中加入低、中、高等3个浓度水平的混合标准溶液和一定量的内标溶液,每个浓度水平平行处理6份,按照仪器工作条件进行分析,计算各目标物的日内回收率和测定值的相对标准偏差(RSD);按照同样的方法,连续6 d,每天制备低、中、高等3个浓度水平的空白加标样品,按照仪器工作条件进行分析,计算各目标物的日间回收率和测定值的RSD,结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表3(续)

结果显示:14种目标物的日内回收率为78.2%～120%,测定值的RSD为1.6%～10%,日间回收率为75.3%～118%,测定值的RSD为1.3%～9.7%,表明该方法具有较好的准确度、精密度和重现性,满足鱼类样品中麻醉剂残留检测分析的要求。

2.7 样品分析

按照试验方法对市售的草鱼、黑鱼、鮰鱼、鲫鱼、江团、鲤鱼、鲢鱼、鲈鱼、鲟鱼等33份鲜活淡水鱼样品进行分析,其中草鱼样品的总离子流色谱图见图3。

图3 总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatogram

结果显示,4份草鱼、1份黑鱼、1份鮰鱼、2份鲫鱼、1份江团、3份鲤鱼、2份鲢鱼、1份鲈鱼共15份样品中检出丁香酚,检出率为45.5%,最低检出量为0.013 6 mg·kg-1(草鱼),最高检出量为0.462 mg·kg-1(草鱼),其余麻醉剂均未检出。

本工作提出了通过式固相萃取-GC-MS/MS同时测定淡水鱼中14种麻醉剂含量的方法。样品经乙腈提取后,使用通过式PRiME HLB柱净化,在浓缩过程中加入微量DMSO,有效减少了目标物的损失,提高了检测的灵敏度。该方法具有杂质干扰小、准确度好、灵敏度高、方法简便快捷等优点,各项技术指标均能满足日常检测分析要求,适用于鱼类样品中多种麻醉剂残留的同时检测和快速确证。