基于响应面法的茯苓液体发酵工艺优化及其活性成分含量测定

黄群，周应娟，陈光欣，李晨，万德光，李羿▲

(1成都医学院，四川 成都 610500；2成都中医药大学，四川 成都 611137)

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核，始载于《神农本草经》，具有利尿渗湿和健脾宁心之效[1]。茯苓含有多糖类、三萜类和氨基酸等多种化合物，其中茯苓多糖和三萜是其主要活性成分[2]。茯苓作为药食两用的传统中药材，是多种中药方剂配伍的要药，配伍率达70%以上。在2019新冠肺炎治疗方案中，由茯苓配伍的多个中药组方疗效较为显著。茯苓还是众多中成药及食品的原料，应用于医药、食品和化妆品等多个领域，具有广阔的应用前景。

茯苓产量呈现逐年递增的态势，2019年茯苓全国产量已达17万余吨。茯苓的野生资源因无序采挖而致逐渐枯竭，目前主要依赖于人工栽培，但存在需要消耗大量的松木资源(每生产1吨茯苓需要砍伐20 m3松木)、生产周期长和易受环境条件影响等不足，难以满足社会的需求[3-6]。为贯彻习近平总书记“宁要绿水青山，不要金山银山”的生态文明理念[7]，保护生态环境，亟待寻找新的茯苓生产方式。使用液体发酵技术生产茯苓，具有生产周期短、培养工艺易调控等优势，在短期内可获得大量茯苓代谢产物，易于实现工业化生产，可有效解决茯苓人工栽培中的不足。目前，对液茯苓体发酵培养工艺优化的相关研究多集中于摇瓶转速、培养温度、培养时间、培养基的氮源和碳源的种类[8-11]，且仅对液体发酵茯苓多糖类成分研究较多[12-15]。基于此，本研究采用响应面法，从茯苓菌种的接种量、碳源浓度与氮源浓度三个方面来优化茯苓的液体发酵工艺，以优化后的工艺条件生产液体发酵茯苓，比较栽培茯苓和液体发酵茯苓的总多糖和总三萜的含量差异，以期为寻找茯苓新的生产方式和促进茯苓资源的开发利用提供参考。

1 材料

1.1 试验材料

茯苓菌种购自巴中市通江县；栽培茯苓购自云南普洱，经成都医学院李羿教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核。

1.2 实验试剂

无水葡萄糖(福晨天津化学试剂有限公司，批号：20200811)；酵母膏(北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：01-014)；蛋白胨(北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：01-001)；熊果酸标准品(成都埃法生物科技有限公司，批号：77-52-1)；D-无水葡萄糖标准品(成都埃法生物科技有限公司，批号：AF9053027)。

1.3 实验仪器

CHA-SA数显气浴恒温振荡器(常州普天仪器制造有限公司金坛市晶玻实验仪器厂)； SW-CJ-2FD洁净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)； KQ100DB超声水浴锅(昆山市超声仪器有限公司)；UTC16D0007双光束紫外可见分光光度计(翱艺仪器上海有限公司)。

2 方法

2.1 培养基制备[8]

2.1.1 茯苓菌种种子液的制作

照表1茯苓液体种子培养基配方配置培养基，分装灭菌备用。从菌袋中挑取适量茯苓菌块，接种至液体种子培养基中。28℃，离心力6.24 g条件下摇瓶振荡培养5 d。

表1 培养基组方

2.1.2 茯苓种子液的甘油保存

吸取0.7 mL “2.1.1”项下种子液于1.5 mL无菌EP管中，加入无菌甘油0.3 mL，混匀后-20℃低温保存[16-17]。

2.2 响应面法优化液体发酵培养工艺

单因素预实验结果表明：接种量以5.00%为宜，碳源浓度以3.00%为宜，氮源浓度以1.00%为宜。以响应面设计法优化液体发酵茯苓培养工艺，把茯苓菌丝干质量作为指标，对A接种量、B碳源浓度、C氮源浓度进行三因素三水平的响应面分析试验[18]。各影响因素与水平见表2。

表2 因素与水平表

将优化得到液体发酵茯苓最佳培养工艺进行3次平行实验，以验证该工艺的稳定性。

2.3 茯苓总多糖的提取及含量测定

2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

准确配制0.16 g/L的葡萄糖标准溶液。精密吸取梯度浓度的标准溶液于试管中，加水至2 mL，依次加入5%的苯酚溶液和浓硫酸，混匀后50℃水浴加热20 min，然后冷水浴10 min，495 nm处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线[19]。

2.3.2 总多糖含量测定

称取液体发酵茯苓和栽培茯苓粉末各1 g，加入1 moL/L 的NaOH溶液50 mL，50℃超声提取1 h。取滤液0.01 mL于试管中，同法显色，测定紫外吸光度计算总多糖含量。

2.4 茯苓总三萜的提取及含量测定

2.4.1 熊果酸标准曲线的绘制

准确配制0.2 g/L的熊果酸标准溶液。精密吸取梯度浓度的标准溶液于具塞试管中蒸干，依次加入5%香草醛-冰醋酸和高氯酸溶液，混匀后50℃水浴20 min，然后冷水浴10 min，加冰醋酸5 mL混匀，在550 nm处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线[20-21]。

2.4.2 总三萜含量测定

各称取液体发酵茯苓和栽培茯苓粉末1 g，加入甲醇50 mL，50℃超声提取3次，每次1 h，合并滤液后定容至10 mL。取0.1 mL，蒸干，同法显色，测定紫外吸光度计算其总三萜含量。

2.5 栽培茯苓和发酵茯苓的性状比较

分别取少量云南茯苓粉末和液体发酵茯苓菌丝粉末于载玻片上，滴入蒸馏水后搅拌均匀，盖上盖玻片，用滤纸吸干多余的液体。将制备好的临时装片置于显微镜下观察。

3 结果

3.1 响应面优化试验结果

通过响应面设计法对液体发酵茯苓三个培养工艺进行优化分析，得到的方法及结果见表3，方差分析见表4，各自变量间交互作用响应面三维图见图1。

表3 响应面试验结果

表4 方差分析结果

图1 响应面三维图

在单因素试验基础上开展响应面试验，以菌丝体干质量(Y)作为响应值，对A接种量、B碳源浓度、C氮源浓度进行设计试验，得到茯苓菌丝体干质量响应面回归模拟方程：Y=7.32+0.063A+0.014B-0.13C+0.82AB-0.35AC+1.00BC+0.95A2-0.22B2-0.82C2。

通过响应面分析法预测得到的最佳工艺为：接种量6.93%、碳源浓度3.15%、氮源浓度0.96%，预测所得茯苓菌丝体干质量应为8.27 g/L。考虑操作方便等因素，将其修正为：接种量6.90%、碳源浓度3.10%、氮源浓度1.00%。

在最佳培养工艺条件下，进行平行3次验证试验，得到茯苓菌丝干质量为(8.26±0.05)g/L(RSD=0.57%，n=3)，偏差率0.12%，说明该回归模型建立合理，具有良好的预测性。

3.2 茯苓总多糖含量测定结果

栽培茯苓和液体发酵茯苓的多糖含量分别为76.63%和44.80%，液体发酵茯苓的总多糖含量低于栽培茯苓。葡萄糖标准曲线见图2，栽培茯苓和液体发酵茯苓的总多糖测定结果见表5。

表5 栽培茯苓和液体发酵茯苓的多糖含量

3.3 茯苓总三萜含量测定结果

栽培茯苓和液体发酵茯苓的总三萜含量分别为5.76%和2.48%，栽培茯苓的三萜类化合物含量高于液体发酵茯苓。熊果酸标准曲线见图3，栽培茯苓和液体发酵茯苓的总三萜测定结果见表6。

表6 栽培茯苓和液体发酵茯苓的三萜类含量

3.4 性状比较结果

栽培茯苓粉末呈白色，显微镜下，菌丝呈不规则团块状，有分枝，见图4；发酵茯苓粉末呈浅棕黄色，显微镜下观察其菌丝形态细长，分枝较多，且存在隔膜，见图5。通过以上显微结构图可知，液体发酵茯苓菌丝分枝较栽培茯苓更多，其原因在于液体发酵具有易分散、发菌点多、萌发快的优点；但其粗壮程度不及传统栽培茯苓，其原因在于栽培茯苓菌丝缠结紧密，成熟度更高。

4 讨论

茯苓液体发酵培养基配方和发酵条件均会对茯苓菌丝的生长和代谢产物的积累产生影响，而液体发酵培养基中碳源浓度、氮源浓度和茯苓液体菌种接种量是其液体发酵中的重要影响因素。因此，本研究采用响应面设计法优化茯苓液体发酵中碳源浓度、氮源浓度和接种量三个因素，筛选其最佳液体发酵工艺。由表4可知该响应面模型p<0.01极显著，失拟项p>0.05不显著，表明该模型具有统计学意义，拟合程度高。3个单因素对菌丝体干质量的影响主次顺序为C>B>A，即：氮源浓度>碳源浓度>接种量。筛选的最佳茯苓液体发酵工艺为：接种量6.90%、碳源浓度3.10%、氮源浓度1.00%，此工艺下得到的菌丝干质量为(8.26±0.05)g/L。验证实验表明：该工艺精密度和重复性较好，稳定可行。

测定并比较液体发酵茯苓和栽培茯苓总多糖和总三萜的含量，液体发酵茯苓和栽培茯苓的总多糖含量分别为 44.80%和76.63%，总三萜含量分别为2.48%和5.74%，液体发酵茯苓中总多糖和总三萜的含量分别是栽培茯苓的0.58倍和0.43倍。液体发酵茯苓总多糖和总三萜水平均偏低，其原因在于栽培茯苓和液体发酵茯苓的培养基和培养方式存在较大的不同，且茯苓液体发酵培养时间(5 d)显著短于栽培茯苓培养时间(180～240 d)，从而导致两者的代谢途径和代谢产物含量存在差异。研究表明，茯苓液体发酵中菌丝体生长时，可同时合成菌丝体多糖和向培养液中分泌胞外多糖，且胞外多糖含量高于菌丝体多糖[22]。由于中药成分的积累是一个动态的过程，其涉及环境、遗传和生物多样性等因素[23]。三萜类化合物的合成受次生代谢途径和环境因子的调控，当温度升高时可促进茯苓总多糖等活性成分的积累，但同时也会一定程度抑制其总三萜等成分的积累。因此，自然环境下昼夜温差较大等因素有利于栽培茯苓总三萜成分的积累，导致其总三萜成分含量高于液体发酵茯苓。

综上，液体发酵生产茯苓具有生产周期短和不受环境影响的优势，可较快速地产生茯苓多糖和三萜类化合物等重要次生代谢产物，有望为茯苓资源的开发和解决困扰茯苓生产多年菌木矛盾的难题提供新思路。笔者计划将进一步开展液体发酵茯苓和栽培茯苓的药效学比较的研究，以期为茯苓液体发酵生产工艺的应用推广和茯苓资源的开发打下基础。