玛卡复方提取物对游泳力竭小鼠抗疲劳的影响

杨采霞,王松涛，黄张君，李阳，牛曼思，沈才洪▲，国锦琳▲

(1.成都中医药大学 泸州老窖养生酒研究中心，四川 成都 611137； 2.泸州品创科技有限公司，四川 泸州 646000)

疲劳是指机体在生理过程中不能维持预定的运动和工作的输出。重复和持续的体力运动很容易导致疲劳，严重影响人类健康[1]。玛卡(LepidiummeyeniiWalp)是一种生长于南美秘鲁的十字花科独行菜属草本植株，是一种享誉全球的健康食品，具有抗疲劳功效[2]。安第斯山脉中部人群一直运用玛卡疗养身体，至今未发现其有任何毒性报道[3]。目前玛卡的药理活性研究主要集中在单味玛卡提取物抗疲劳方面[4-6]，没有玛卡复方作用的相关研究。本项目在国医大师郭子光指导下以玛卡配伍枸杞子、覆盆子、无花果、白扁豆四味药食同源中药组成了玛卡抗疲劳复方。研究表明，运动时主要的供能物质是糖，而糖原是转化产生大量糖的基础，集体中大量的糖原储存能有效地抵抗大量消耗性运动导致的疲劳[7-8]。在剧烈运动时机体处于缺氧的状态，肌肉细胞通过无氧糖酵解供能，但伴随着产生的大量乳酸会使得细胞中的游离H+增加，使肌肉细胞内环境失衡，肌肉运动能力下降，诱导疲劳感[9-10]；在长时间运动后，机体糖和脂质类物质耗竭，机体会动员蛋白质与氨基酸参与分解代谢，产生尿素氮代谢产物，血中尿素氮水平可反映机体疲劳程度[11]。基于此，本研究选用小鼠负重游泳经典模型[12]，测定小鼠游泳力竭时间以及血液中乳酸、尿素氮水平等指标来评价玛卡复方提取物对小鼠抗疲劳效果，同时评价玛卡复方水提物对小鼠主要代谢器官的影响。

1 材料

1.1 试验药物

玛卡、枸杞子、覆盆子、无花果和白扁豆均为上海天源植物制品有限公司按照《中华人民共和国药典》和新食品原料要求从新荷花中药饮片股份有限公司采购，经成都中医药大学国锦琳教授鉴定为十字花科独行菜属植物玛卡(LepidiummeyeniiWalp)的干燥根茎、茄科植物枸杞属植物宁夏枸杞(LyciiFructus)的干燥成熟果实枸杞子、蔷薇科悬钩子属植物华东覆盆子(RubiFructus)的干燥果实覆盆子、桑科榕属植物无花果(Ficuscarica Linn)的干燥成熟果实无花果、豆科植物扁豆属植物扁豆(LablabSemenAlbum)的干燥成熟种子白扁豆。用1∶10沸水提取3次，减压浓缩至比重1.30-1.50，喷雾干燥，1 g最终提取物产品相当于15 g饮片。

1.2 动物

选用昆明种雄性小鼠(SPF级),窝龄21 d，体质量(12±2)g，购自成都达硕实验动物有限公司[动物生产许可证号：SCXK(川)2020-030]。小鼠适应性喂养1周后用于正式实验。

1.3 试剂和仪器

本实验中所用的主要试剂和仪器的具体信息在表1中列举，其他未列出的试剂均为分析纯或者更高纯度。

表1 试剂和仪器信息

2 方法

2.1 实验动物分组和剂量设计

将120只小鼠随机分成3个试验组(即A、B、C试验组)，每个试验组分别设置1个空白对照组和3个用药组，每组10只小鼠[13]。按照玛卡复方提取物推荐的人体用药剂量(3.00 g/60 kg)换算小鼠的灌胃给药剂量(即人体的5倍、10倍、20倍)，设置玛卡复方提取物低、中、高用药组(玛卡复方提取物0.25 g/kg、0.50 g/kg、1.00 g/kg)。实验中所有的药物均采取以生理盐水溶解后按照每天的用量当天制备，每只小鼠每天灌胃给药体积0.2 mL/10 g，持续给予30 d，空白组小鼠给予相同体积的生理盐水。

2.2 小鼠体质量增长测定

小鼠在实验期间，可以自由获得饮食和饮水，实验第1天对小鼠进行体质量测定后，以后每3 d对小鼠进行一次体质量测定。最后，将30 d内获得的小鼠体质量以10 d为时间段整理实验期间玛卡复方提取物对小鼠体质量的影响[14]。

2.3 负重游泳实验

A试验组在最后一次灌胃给药30 min后，测定小鼠体质量，根据其体质量换算铅皮质量(铅皮质量=体质量×5%)，在每只小鼠距离尾根部1 cm处系上铅皮，放入水深30 cm，水温(25±1)℃的游泳箱内，记录小鼠自放入游泳开始至死亡的时间[15]，期间，若有小鼠处于不动状态，可以用木棍搅动水面，保证小鼠运动。

2.4 生化指标检测

B试验组，末次给药30 min后，将各组小鼠分别放入设置好水温为(30±1)℃，水深为30 cm的水中自由游泳90 min，游泳结束后迅速捞起小鼠并用干毛巾加速小鼠干燥后放于干净的鼠笼内休息60 min后，摘眼球采血，所有血液样本放置于4℃冰箱过夜，以1 000 g离心10 min分离得到血清，测定血清中的BUN、BLA。C试验组，末次给药30 min后，在静息状况下收集小鼠的部分肝脏、肾脏和小腿后肢肌肉，-80 ℃冰箱贮存，检测糖原水平[16]。

2.5 肝肾组织病理学检查

C试验组收集的部分肝脏组织和肾脏组织，迅速用4℃生理盐水洗净后，固定在4%多聚甲醛溶液中[17]。固定好的组织按照HE染色制片要求制片并采用Pannoramic250数字切片扫描仪对切片进行图像采集，每张切片先于40倍下观察全部组织，随后选择要观察的区域100倍下观察具体组织结构，采集图片。

2.6 数据处理

3 结果与分析

3.1 玛卡复方提取物对小鼠体质量的影响

在给药的30 d内，小鼠体态和毛色正常且体质量循序增加。各时间点，各组小鼠的体质量比较，差异没有统计学意义(P>0.05)，提示用药组用药后小鼠的正常生长发育未改变(见表2)。

表2 小鼠体质量

3.2 玛卡复方提取物对小鼠负重游泳时长的影响

玛卡复提取物中、高剂量组的负重游泳时长较空白组长(P<0.05)，中剂量组小鼠在水中负重游泳时间最长(见表3)。玛卡复方提取物低、中、高各组分别对应的延长小鼠在水中负重游泳时间的增长率为36.96%、56.52%、33%，提示中剂量玛卡复方提取物的用药量可能为最佳用药量。小鼠水中负重游泳时间的增长率=(剂量组游泳时间平均值-空白组游泳时间平均值)/空白组游泳时间平均值×100%。

表3 小鼠负重游泳时间

3.3 玛卡复方提取物对小鼠血清中乳酸水平的影响

给药组小鼠的血清乳酸水平低于空白组(P<0.05)，与剂量成负相关(见表4)。玛卡复方提取物各剂量组对应的加快BLA的代谢率为35.52%、43.61%、51.41%，其中高剂量组的代谢率最大，说明玛卡复方提取物可以通过加速清除小鼠的乳酸堆积或减少小鼠体内乳酸的产生起到抗疲劳作用。乳酸代谢率=(空白组乳酸水平平均值-剂量组乳酸水平平均值)/空白组乳酸水平平均值×100%

表4 小鼠乳酸水平

3.4 玛卡复方提取物对小鼠尿素氮水平的影响

与空白组比较，给药组小鼠90 min的无负重长时间游泳后的BUN水平降低。低、中、高剂量组分别对应的BUN代谢率为15.55%、40.91%、61.27%，代谢率与与剂量呈正相关，说明复方是通过加快BUN的代谢，减少无负重游泳后小鼠BUN的尿素氮堆积。尿素氮代谢率=(空白组尿素氮水平平均值-剂量组尿素氮水平平均值)/空白组尿素氮水平平均值×100%

表5 小鼠尿素氮水平

3.5 玛卡复方提取物对小鼠糖原的影响

静息状态下，与空白组比较，高剂量组肝糖原、肌糖原水平升高(P<0.05)；低、中剂量组差异没有统计学意义(P>0.05)。各用药组的肝糖原增长率分别为7.19%、15.11%、43.89%，肌糖原增长率分别为1.66%、19.32%、36.20%，表明在静息状态下，玛卡复方提取物可以通过上调小鼠的肝、肌糖原的水平，发挥抗体力疲劳功效。

表6 小鼠糖原水平

3.6 玛卡复方提取物对小鼠肝、肾组织的影响

由图A-D可知，各剂量组的肝小叶分界非常明显，沿其长轴走行的中央静脉内皮管壁完好，肝细胞环绕中央静脉呈放射状分布，形态正常，肝索分布齐整；核仁清晰，未见变性；肝血窦没有扩张，结构正常，没发现瘀血及炎性病变；门管区结构完整，周围没有观察到肝细胞结节状再生和结缔组织广泛增生，未发现淋巴细胞导致的炎性病理改变。由图E-G可知，药物组的肾表面的致密结缔组织完整，未见被膜增厚及炎性分泌；肾实质(皮质、髓质)分界清晰，皮质区肾小球未见毛细血管基底膜或基质增厚，纤维细胞正常分布；肾小囊腔分界明显；肾小管构造完整，未观察到肾小管细胞胞质空泡化，小管内未见细胞及蛋白管型，间质无病理变化；髓质集合管结构完整且清楚，未见病理变化。

注：A-D为肝脏组织切片在光镜下放大100倍的HE染色图；E-G为肾脏组织切片在光镜下放大100倍的HE染色图

4 讨论

玛卡的多肽[18]，多糖[19]，提取物[6]等复合物在抗体疲劳方面的研究较多，但玛卡复方抗疲劳作用研究较少。有研究表明玛卡粉以1.2 g/kg给小鼠持续灌胃30 d后，可以升高小鼠无负重游泳120 min后肝脏和肌肉组织中的糖原水平，抵抗运动疲劳[20]；玛卡粉以1.0 g/kg 灌胃30 d后，玛卡组小鼠的负重游泳时间相比空白组长，玛卡可以明显延长小鼠的游泳力竭时间[21]。玛卡复方醇提物以玛卡醇提浸膏与中药复方浸膏复配，连续给药15 d后，玛卡复方醇提物的负重游泳时间平均值比玛卡醇提物组长，玛卡复方醇提物能提高小鼠游泳时间，降低血清代谢物堆积[22]。有研究表明，玛卡复方水提物的负重游泳时间较玛卡组的负重游泳时间长[20]。玛卡复方提取物组的BUN水平均低于玛卡水提物组[6]。本研究中，玛卡复方水提物 0.25 g/kg、0.50 g/kg、1.00 g/kg 3个剂量均对游泳力竭小鼠具有明显抗疲劳作用，主要表现在使小鼠在水中负重游泳的时间延长，减少堆积在小鼠体内的BLA、BUN代谢产物，使小鼠机体内部的糖原储存增加。BLA、BUN、MG、LG水平变化均与用药有一定的剂量依赖性。对小鼠的肝和肾进行HE染色切片观察，结果显示空白组和3个用药组小鼠肝和肾组织正常，表明玛卡复方提取物不影响肝脏和肾脏的正常代谢活动和能量转换，验证了玛卡复方水提物不损伤小鼠的肝肾组织,具有一定安全性。

在《保健食品检验与评价技术规范》中针对抗疲劳实验指出只要负重游泳得到的结果为阳性，其他的抗疲劳指标有两项是阳性结果就可以判定药物有抗疲劳的功效[13]。本实验中，小鼠的游泳行为学实验结果、蛋白质和糖代谢指标均为阳性，可判定玛卡复方提取物具有缓解小鼠体力疲劳的功效。另外，此复方中的枸杞的抗疲劳功效也有报道[23]。玛卡、枸杞子、覆盆子、无花果和白扁豆这五味药为药食同源，它们组为复方，可以改善玛卡单味药用量大的缺点。本研究主要从代谢产物和能量供应两方面探讨了玛卡复方提取物抗疲劳的效果，疲劳产生的机制较多，后期还可以从抗氧化、脂代谢、肠道菌群等方面研究其可能的抗疲劳机制和相关靶点。同时，本研究结果可促进安全有效缓解体力疲劳保健食品的产生，玛卡复方提取物有待成为人类抗疲劳的一款新型补充剂。