精子顶体酶活性与ART受精率的相关性研究

黄玲,杨帆,江利,杜丹（湖南省郴州市第一人民医院,湖南 郴州 423000）

目前，全世界已婚夫妻中不育症患者约占15%[1]。随着不育症的发病率逐年递增，使得辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）广泛应用于临床。由于不育症的病因既有女性因素也有男性因素，既往学者对女性不育的病因已经做了大量的研究，目前男性因素也在慢慢探索中。精液常规检测作为男性生育力评估的基本方法，由于受男性生理状态、检测仪器及检测人员等条件的不同，使得其检查结果可能存在较大的偏差，有时并不能反映男性生育力的真实状态，在ART治疗及受精方式的选择上可能存在一定的局限性。精子顶体酶是一种胰蛋白酶[2-3]，主要存在于精子顶体中，能够以酶原的形式生成并储存在精子顶体部位，当机体顶体反应发生时，就会激活并释放顶体酶原。顶体酶是非常重要的一种蛋白水解酶，能够为受精卵的结合创造条件。其能够溶解卵子表面的透明带，让精子顺利进入卵细胞中，精子顶体酶活性是精子质量的重要评价指标之一。相关研究显示，精子顶体酶活性与精液常规参数有一定相关性，可以作为评估精子质量的一个客观定量指标[4]，但对于IVF结局的预测价值较低，对ART治疗及受精方式选择的指导意义不明，且其对ART受精结局的影响及机制尚不明确，还需进一步的研究去阐明。因此，本研究的目的在于探讨精子顶体酶活性对男性生育力评估、ART治疗方案的选择及受精率的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2020年1月-2020年12月在我院就诊的852例女子获卵数≥3枚因原发不育来行ART治疗的夫妇作为研究对象。纳入标准：①男方年龄范围22岁-49岁；②同居或婚后未避孕一年以上而未孕者，且为原发性不孕；③男性生殖器官及性功能正常；④半年内未服用对检验结果有影响的药物；⑤女方获卵子数≥3枚。排除标准：①男女双方合并有心脏、肝脏、肾脏等严重的原发性疾病者；②生殖器官有肿瘤或者发育不良者；③有生殖道感染者；④服用严重阻碍生精功能或影响精子活力的抗肿瘤药物者；⑤严重少精子症者。所有研究对象均告知并签署知情同意书，该研究获得我院伦理委员会批准。

1.2 主要仪器设备及检测试剂 精子顶体酶活性定量检查试剂盒购自深圳华康生物医学工程公司，CX33型普通光学显微镜购自日本Olympus公司。HR801型酶标仪购置于深圳华科瑞科有限公司，Eppenddorf AG 5424高速离心机购置于Eppenddorf公司。

1.3 精液样本采集及常规检测分析 纳入对象禁欲3-7天，院内自慰取精，样本采集完成后置于37℃温箱内液化，参照《人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）对精液量、精子浓度、活力和精子形态进行分析[5]。同时留取7.5除以精液浓度乘1000μl新鲜精液量用作精子顶体酶活性检测。

1.4 精子顶体酶活性检测用改良Kennedy法按照试剂盒说明书检测精子顶体酶活性。用酶标仪检测精子顶体酶活性的OD值，用公式计算精子顶体酶活性：体酶活性（μIU/106精子）=（测定管OD值-空白管OD值）/（247.5×7.5）×106。

1.5 统计方法 采用SPSS25.0统计软件对数据进行处理。定性资料分析采用卡方检验，用率（%）表示。定量资料结果符合正态分布的采用t检验，用均值±标准差（）表示。非正态分布的采用非参数检验（Mann-WhitneyU检验）分析，用秩和检验作组间对比。用Pearson相关性分析各参数与精子受精率的相关性。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵子受精率相关因素分析 对纳入研究的对象基本信息及精液常规参数与卵子受精率展开相关性分析，发现其与男方年龄、女方年龄、精子顶体酶活性及卵子成熟度相关（P＜0.05），相关系数r分别是0.090、0.124、0.096及0.491。与禁欲天数、精液量、精子浓度、精子前向运动（PR）、精子非前向运动（NP）、正常形态率、精子DNA碎片率（DFI）及精子的抗精子抗体（MAR）不相关（P＞0.5），详见表1。

表1 卵子受精率与研究对象基本信息及精液参数的相关性

2.2 不同精子顶体酶活性定量结果为参考值时受精率的对比分析 由于本研究中纳入对象精子顶体酶活性定量结果为非正态分布，试剂盒提供的参考值为48.2μIU/106精子。因此对精子顶体酶活性定量结果按单位为μIU/106值分别是35.0、42.2、48.2、51.2、51.7、53.8，并按此参考值分组，低于该值者为异常组，高于该值者为正常组。精子顶体酶活性定量结果按单位为μIU/106值分别是35.0、42.2、48.2、51.2μIU/106时，正常组卵子受精率高于异常组，P值分别是0.018、0.029、0.041、0.048，差异有统计学意义。精子顶体酶活性定量结果按单位为μIU/106精子值分别是51.7、53.8μIU/106时，正常组与异常组间受精率没有统计学差异（P＞0.5）。详见表2。

表2 不同顶体酶活性参考值顶体酶正常与异常组间受精率的对比分析

2.3 女方年龄大于40岁时，精液基本信息与精子顶体酶活性的相关性 由于女性年龄40岁是女性生育重要的年龄节点。本研究中将纳入对象女方年龄大于40岁的99对夫妻，按顶体酶活性51.2μIU/106分组，大于51.2μIU/106者为精子顶体酶活性正常组，小于等于者为异常组。对于两组间精液的量、精子浓度、前向运行精子比率（PR）、非前向运动精子比率（NP）、不动精子比率（IM）、抗精子抗体比率（MAR法）、精子DNA碎片率（DFI）、精子畸形率、男女双方年龄等相关指标在精子顶体酶活性正常组与异常组间受精率没有统计学差异（P＞0.5）。详见表3。

表3 女方年龄＞40岁顶体酶分组统计相关性

3 讨论

近年来，随着社会压力及竞争力的不断增加，就业压力加大及自然环境的不断恶化，不孕不育的发病率逐年上升。世界卫生组织就将不孕不育、肿瘤及心脑血管疾病共同列为21世纪三大疾病[6]。不孕不育带给社会和家庭的负担是难以想象的，不仅加重经济负担，还会给患者带来很大的心理压力。目前，不孕不育由单方因素或男女双方因素造成。根据相关流行病学调查显示，在不孕不育夫妇中，约有40%-50%为女方因素，25%-40%是男方因素，双方因素占20%-30%，剩余10%为不明原因[7]。随着男性不育的患者数量不断增加，男性不育因素也受到了社会多方面的广泛重视。不孕不育的治疗除常规药物和手术外，近些年来辅助生殖技术在临床上的应用，从很大程度上缓解了不孕不育夫妇的痛苦。辅助生殖技术体外授精方式的选择要结合精子浓度、精子形态和精子活力等多种因素[8]。对于不育症患者使用精液常规分析选择授精方式，常规IVF治疗方案中仍有可能出现低受精或完全不受精的情况。据文献报道，在常规IVF中，发生低受精（包括完全不受精）的比率为3%-5%[9-10]。对此，采取有效方式预防或避免受精失败及提高受精率提升IVF的成功率是临床的重点问题。

在辅助生殖技术的早期研究[11-12]中发现精子参数与受精结果有较强相关性，临床妊娠结局不受精子常规参数的影响，却与女性配偶的生育状态和年龄的相关性更强。所以本研究排除影响女性怀孕的干扰因素后大大减少入组病例数，这样能更好地做好质控控制和单因素的分析，将研究重点关注在精子参数、顶体酶与受精能力的相关性上。在此条件下，在本研究中，对纳入研究的对象基本信息及精液常规参数与卵子受精率进行相关性分析，发现其与男方年龄、女方年龄、精子顶体酶活性及卵子成熟度相关。这说明顶体酶是影响受精率的相关因素。这与赵淑芹[13]的研究亦证明了精子顶体酶活性与IVF受精率呈正相关性的结论一致。Henkel[14]等人对114名行IVF治疗的男性的精子顶体酶活性与IVF受精率的相关性进行了研究，发现精子的受精潜力与精子顶体酶活性相关，另外有一些学者也得出了同样的结论[15]。由此可见，精子顶体酶活性在受精过程中起着非常重要的作用。

在本研究中，纳入对象精子顶体酶活性定量结果为非正态分布，试剂盒提供的参考值为48.2μIU/106。不同实验室由于仪器设备及检验人员的不同，其结果可能有所偏差。对此，对纳入对象的精子顶体酶活性定量结果进行秩和检验，由于小于参考值的纳入对象为101名，对其按组间间距分3组，其对应精子顶体酶活性定量结果按单位为μIU/106值分别是35.0、42.2、48.2。低于该值者为异常组，高于该值者为正常组。正常组卵子受精率高于异常组，P值分别是0.018、0.029、0.041，差异有统计学意义。同样精子顶体酶活性为51.2μIU/106时，正常组受精率高于异常组（P=0.048）。精子顶体酶活性定量结果按单位为μIU/106值分别是51.7、53.8μIU/106时，正常组与异常组间受精率没有统计学差异（P＞0.5）。提示精子顶体酶活性定量结果51.2μIU/106可能是本实验室的参考值，这与王金保[16]等人的研究结果顶体酶正常组受精率高于异常组，差异无统计学意义。但对于顶体酶异常组进一步组间间距分组发现顶体酶小于25μIU/106受精率明显均低于正常组，差异有统计学意义。这可能与各实验室仪器设备及操作人员不同相关。同时，本研究数据样本量不大，还需进一步深入研究。

对于女性年龄大于40岁的夫妻中，笔者发现在顶体酶正常组与异常组中，在男女双方年龄、精液常规参数、精子DFI、精子形态率均无统计学差异的条件下，两组间的受精率无统计学差异。这可能与女性年龄是影响生育力及妊娠结局的独立危险因素相关[17]。这也说明当女性年龄大于40岁时，男方的基本精液参数对于女性受精率的影响参考意义不大。

因此，在辅助生殖助孕的过程中，需要考虑夫妻双方的情况合理地选择受精方式，在女性年龄小于40岁时，顶体酶是影响受精率指标之一；当顶体酶活性＜51.2μIU/106时，可以考虑选择ICSI的受精方式来助孕。