精子顶体发育相关蛋白的研究进展

常天晴，吴华，冯睿芝，钱云

精子发生由一系列复杂而精细的生物学过程构成，主要包括有丝分裂、减数分裂和精子变形。精子变形是指减数分裂后期形成的单倍体圆形精子细胞经过一系列的形态变化最终成为成熟精子的过程，包括染色质重塑、顶体形成、线粒体重排、鞭毛组装和细胞质残余体移除等[1]。顶体形成是精子变形过程中的重要事件，涉及前顶体囊泡的形成和运输、前顶体囊泡的融合、顶体在细胞核上的附着等主要生物学事件。精子顶体各阶段的发育均受到相关蛋白的精确调控，蛋白之间相互作用并表现出复杂的分子调控机制，相关蛋白的异常导致精子顶体结构异常和功能障碍，从而引起男性生育力减退甚至不育。有研究发现，自噬机制参与了顶体形成过程中高尔基体源性囊泡运输和融合过程[2]。尽管对于精子发生过程中顶体的形态变化已有充分的研究，但其精确的分子调控机制仍有待进一步的发掘。本文按照顶体发育相关的生物学事件发生顺序，对近年相关蛋白的研究进行综述，以探讨顶体形成背后复杂的蛋白调控网络，并提出了未来进一步的研究方向。

1 顶体的形成及其功能

1.1 顶体的形成顶体的形成分为四个阶段：高尔基体阶段、顶帽阶段、顶体阶段和成熟阶段[3]。在高尔基体阶段，高尔基体产生前顶体囊泡，之后对其进行分类并运送至核表面，在核表面前顶体囊泡融合形成一个大的顶体囊泡[4]。在顶帽阶段，顶体囊泡变大，糖蛋白含量增加，并扩散到细胞核上形成类似帽子的结构。在顶体阶段，顶体发生缩合并附着在顶体内膜上，染色质凝聚。最后的成熟阶段细胞核继续浓缩，核形态发生变化，顶体发生迁移，顶体颗粒遍布整个顶体膜，顶体分化为前部和后部[5]。

1.2 顶体的功能顶体是精子特有的细胞器，呈帽状覆盖在精子核的前部，其内充满了促进精子-卵子相互作用的蛋白水解酶和受体。顶体是精子与透明带结合和穿透的基础，其帮助精子穿过放射冠和透明带，释放出一系列顶体酶并与卵母细胞融合，发生顶体反应，其正常形态和功能对受精起决定性作用。顶体反应是保证受精成功的关键步骤之一，在此过程中，外部的顶体膜与内部的精子细胞质膜融合，导致顶体酶的释放，从而分解卵子的外部保护层，使精子到达卵子的细胞质[6]。

2 前顶体囊泡的形成和运输相关蛋白

高尔基体相关囊泡的形成和运输是顶体形成过程中的重要事件。液泡蛋白分选（vacuolar protein sorting，VPS）家族成员VPS13B定位于高尔基体膜，与高尔基体相关的小GTP酶RAB6相互作用[7]。Da Costa等[4]研究发现，VPS13B对于前顶体囊泡的正常运输是必需的。VPS13B在高尔基体阶段精子细胞的前顶体囊泡中表达，Vps13b-/-雄性小鼠不育，表现出严重的少弱畸形精子症。VPS13B蛋白的缺失导致精子顶体发生受损，精子细胞的前顶体囊泡没有到达核膜，而是最终被包裹在溶酶体中，精子细胞变形或形成异常圆头精子细胞，精子浓度、活力均明显降低。

Rab蛋白是一类小GTP酶，调节真核细胞内的小泡运输；Rab2对于成熟降解的内溶酶体和自溶酶体的生成至关重要[8]。研究显示，具有序列相似性的家族71成员F1（family with sequence similarity 71 member F1，FAM71F1）是睾丸优势表达蛋白，含有RAB2B结合区。也有研究发现睾丸组织FAM71F1的表达在男性不育患者中显著下调[9]。Morohoshi等[6]研究表明，FAM71F1与活性RAB2A/B结合形成的复合物抑制了顶体形成过程中过度的囊泡运输。Fam71f1-/-小鼠的精子顶体在圆形精子细胞阶段异常扩张，顶体反应相关的精卵融合蛋白1（izumo spermegg fusion protein 1，IZUMO1）受到损害，因此FAM71F1对于正确的顶体形成和正常的雄性生育是必需的[6]。

最近的研究发现，纤维鞘相互作用蛋白（fibrous sheath interacting protein，FSIP）在顶体囊泡形成中具有重要作用。Gamallat等[10]研究发现，FSIP1不仅是一种纤维鞘细胞骨架蛋白，而且是一种参与长形精子细胞基本结构的必需蛋白。FSIP1缺失影响精子发生核心蛋白的表达，减弱了鞭毛内运输蛋白的功能，显著下调了大多数参与顶体囊泡形成的蛋白质，因而在顶体发生和鞭毛形成中发挥关键作用。FSIP1蛋白在圆形精子细胞中表达最高，与顶体囊泡蛋白1（acrosomal vesicle protein 1，ACRV1）相互作用，并在第9～12步精子形成期间从细胞核移位到顶体。Fsip1-/-小鼠是不育的，精子数量和活力显著下降，精子头部畸形，鞭毛组装失败，顶体囊泡破裂[10]。Fang等[11]研究发现，FSIP2过表达小鼠圆形精子细胞中上调基因在顶体囊泡中富集，FSIP2在顶体区域与ACRV1相互作用调节ACRV1蛋白的表达，进而参与顶体形成。Zheng等[12]通过全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）在弱精子症患者中发现了新的双等位基因FSIP2变异体，通过综合形态学分析，在患者的精子中观察到大量圆头精子和（或）顶体发育不全精子，免疫荧光技术（immunofluorescence technique）显示，FSIP2在人类和小鼠精子形成过程的各个时期的顶体中都有表达。进一步研究表明，FSIP2和参与顶体发育的蛋白[如热休克蛋白90B1（heat shock protein 90 beta family member 1，HSP90B1）、KIAA1210、HSPA2]相互作用，并且FSIP2调节DPY19L2（dpy 19-like 2）和精子顶体相关蛋白1（sperm acrosome associated 1，SPACA1）的表达。

另有研究表明，着丝粒蛋白E（centromeric protein E，CENP-E）以紧凑的结构沿着微管运送相关物质[13]。She等[14]研究发现，CENP-E在精子发生过程中介导膜运输和囊泡运输，对顶体形成具有重要作用。小鼠睾丸长期注射变构抑制剂GSK923925特异性抑制CENP-E后，睾丸生精小管结构紊乱，生精过程中断，长形精子细胞形态异常。组织化学及透射电子显微镜分析显示，CENP-E被GSK923925抑制后，顶体形态不规则，顶体颗粒散在分布于细胞质中，高尔基体源性囊泡的数量显著减少[14]。

3 前顶体囊泡融合相关蛋白

前顶体囊泡形成后被运输至精子的细胞核表面，在细胞核表面相互融合形成一个大的顶体囊泡，相关蛋白异常会造成囊泡融合失败从而影响顶体的正常发育。AU040320是一种高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，定位于质膜、核内体、高尔基体和反面高尔基体管网状结构蛋白（trans Golgi network，TGN）。Guidi等[15]研究发现，AU040320蛋白定位于生殖细胞的TGN，但在成熟的顶体中未检测到，表明该蛋白可能是前顶体囊泡正常形成所必需的。AU040320-/-雄性小鼠不育，精子运动能力受损，头部畸形，缺乏顶体结构，进一步的精子超微结构分析显示，前顶体囊泡在圆形精子细胞顶体附近积聚，但不能融合成单个顶体囊泡，最终导致顶体发育异常。

高尔基体基质蛋白130（Golgi matrix protein 130，GM130）是一种与高尔基体膜紧密结合的高尔基体基质蛋白，与高尔基体囊泡转运蛋白P115和高尔基体重组与堆叠蛋白65（Golgi reassembly stacking protein 65，GRASP65）相互作用，在内质网囊泡与高尔基体膜融合过程中发挥重要作用，从而保持高尔基体结构的完整性[16]。研究发现，GM130-/-雄鼠不育，精子缺乏顶体结构、头部呈圆形、线粒体鞘组装异常，与人类圆头精子症特点一致[17]。免疫荧光结果显示，精子发生过程中P115和GRASP65蛋白不能被募集到高尔基体中，导致高尔基体的碎片化，许多高尔基体衍生的前顶体囊泡聚集在髓质区而未能融合成单个大顶体囊泡[17]。此外，睾丸生精细胞中衔接蛋白1（adaptin 1）和TGN46的共定位被破坏，这表明顶体发生异常可能是由于生精细胞中高尔基体衍生的前顶体囊泡未能正确组装而导致囊泡融合失败，最终引起GM130-/-雄鼠完全不育[17]。

高尔基体微管相关蛋白210（Golgi-microtubuleassociated protein of 210 kDa，GMAP210）也被称为甲状腺激素受体相互作用物11（thyroid hormone receptor interactor 11，TRIP11），对维持高尔基体正常形态和功能起重要作用。GMAP210是鞭毛内转运蛋白20（intraflagellar transport 20，IFT20）的高尔基膜受体，二者在高尔基体内共同发挥作用[18]。研究已证实IFT20在精子发生和雄性生殖中发挥重要作用[19]。Wang等[20]研究发现，GMAP210蛋白在睾丸和肝脏中高表达，在睾丸发育过程中GMAP210的表达水平随年龄增长而增加。在顶体形成的正常过程中，前顶体囊泡的融合以及一些顶体蛋白的正常表达和定位都需要GMAP210参与。生殖细胞特异性Gmap210-/-雄性小鼠生育力显著下降，精子头部呈长椭圆形并缺乏顶体，进一步超微结构分析显示，精子细胞中的高尔基体更加分散，前顶体囊泡没有融合，因此不能形成帽状顶体囊泡。此外，Gmap210-/-小鼠睾丸SPACA1、透明带结合蛋白1（acrosomal protein zona pellucida binding protein 1，ZPBP1）和IFT20的表达水平显著下降，IFT20在各级生精细胞中的定位亦发生异常[20]。

中心体蛋白70（centrosomal protein 70，CEP70）属于CEP家族，在人类精子发生的不同阶段都有表达，特别是在减数分裂和变形阶段高表达[21]。CEP70还参与微管的伸展和动态调节[22]。Liu等[23]研究发现，小鼠CEP70的缺失导致与精子鞭毛、头部、顶体和微管细胞骨架形成相关的蛋白显著减少，精子发生受阻于Ⅶ期和Ⅷ期，大部分圆形精子细胞不能发育至长形精子细胞，Cep70-/-小鼠精子细胞高尔基体阶段可以发现多个顶体结构，而顶帽阶段和成熟阶段检测到空泡化或不规则形状的顶体，顶体基质成分显著下调，精子发生异常而最终引起不育。

4 顶体在细胞核上附着的相关蛋白

除了被运输到细胞核表面并融合形成单个大的顶体囊泡外，顶体在细胞核上的附着对其功能也非常重要。DPY19L2蛋白在睾丸中高度表达，位于精子核膜的内膜上，面向顶体，并认为其功能障碍与圆头精子症的发生有关。在Dpy19l2敲除的小鼠精子细胞中，顶体基质不再与顶体紧密结合，顶体无法沿细胞核延伸，最终因顶体形成障碍而导致圆头精子的形成[24]。Castaneda等[5]研究发现，序列相似家族209（family with sequence similarity 209，FAM209）在哺乳动物睾丸中特异性表达，是第一个被证明与DPY19L2相互作用的蛋白，定位于内核膜上并对顶体发育至关重要。在小鼠出生后第20天，睾丸Fam209基因在RNA水平上被检测到。Fam209-/-小鼠精子活力降低，精子头部畸形，第9步精子细胞中顶体致密物质异常定位，一些晚期精子细胞中顶体缺失[5]。

纤毛和鞭毛相关蛋白65（cilia and flagella associated protein 65，CFAP65）已被证明定位于人类精子的顶体区域和鞭毛中段，CFAP65突变会导致严重的弱精子症，表现为顶体发育不全和鞭毛畸形[25]。Wang等[26]研究发现，在Cfap65-/-小鼠睾丸中，第9步精子细胞的精子头部过度狭窄，并伴有精子领（manchette，精子变形过程中短暂出现的特殊裙摆样结构）结构缺陷和成熟期顶体发育异常。进一步精子超微结构分析显示，顶体沿着核周区异常附着，核周膜中有不规则肿胀和空泡样内容物。蛋白质组学分析表明，当CFAP65缺失时，顶体形成过程中的蛋白质平衡系统被破坏，SPACA1在第11～12步精子细胞中显示异常定位，并且在Cfap65-/-小鼠的成熟精子中不存在；ZPBP在圆形精子细胞中的表达减少，并且未能定位在长形精子细胞的顶体区域[26]。

顶体下层板（acroplaxome）是核膜和顶体内膜之间的特殊骨架结构，是核周层的一部分。Zhang等[27]研究发现肌动蛋白相关蛋白T1（actin related protein T1，ACTRT1）在精子顶体下层板特异表达，与ACTRT2、肌动蛋白样蛋白7A（actin-like protein 7A，ACTL7A）和ACTL9相互作用形成多聚体复合物，并定位于精子细胞的亚染色体区域，Actrt1-/-雄鼠生育率严重降低，精子头部畸形，顶体下层板结构变得疏松，顶体从核膜上脱落。进一步的蛋白相互作用研究发现，ACTRT1可能通过与SPACA1、多腺苷二磷酸核糖聚合酶11[poly（ADP－ribose）polymerase 11，PARP11]和精子发生相关蛋白46（spermatogenesis associated protein 46，SPATA46）相互作用，将发育中的顶体锚定在细胞核上。

磷酸蛋白质组分析表明，在精子发育过程中，有几条依赖于激酶的通路是活跃的，但特定的激酶在精子发生中的作用尚不清楚[28]。Crapster等[29]研究发现，同源结构域相互作用蛋白激酶4（homeodomaininteracting protein kinase 4，HIPK4）是精子顶体发育的重要调节因子，在小鼠精子形成和发育中具有重要功能。HIPK4主要表达于圆形和早期伸长的精子细胞中，Hipk4-/-雄鼠不育，表现出与少弱畸形精子症一致的表型。Hipk4-/-雄鼠精子细胞的顶体与顶体下层板分离，导致头部结构异常。进一步的研究发现在培养的成纤维细胞中，HIPK4的过表达诱导分支的丝状肌动蛋白结构，HIPK4的缺乏改变丝状肌动蛋白的加帽蛋白在睾丸中的亚细胞分布，因而HIPK4在细胞骨架重塑中具有重要作用[29]。

SPACA1是一种定位于顶体内膜的膜蛋白，对于精子发生过程中顶体的扩张和避免顶体的退化和消失是必不可少的[30]。Chen等[31]报道了一个SPACA1的纯合无义突变，该研究使用蛋白质组学分析和蛋白质相互作用技术证明了SPACA1能够与ZPBP和ACTL7A相互作用，因而在诱导顶体颗粒附着和将顶体连接到细胞核的过程中具有重要作用。SPACA1的缺失降低了精子中ACTL7A的表达，并削弱了ACTL7A和SPACA1的相互作用，破坏了顶体基质的稳定性以及顶体与顶体下层板的对接，最终导致顶体发育不全。

5 自噬相关蛋白对顶体形成的作用

自噬是真核细胞在自噬相关基因（autophagy related gene，ATG）的调控下，利用溶酶体降解功能失调或不必要的蛋白质和受损细胞器以维持细胞内正常生理活动及稳态的细胞代谢过程[32]。细胞自噬与精子发生过程中多种生理和病理过程密切相关。Shang等[33]研究发现自噬缺失会导致精子活力下降，精子尾部结构遭到破坏而出现严重的畸形精子症。Lei等[34]研究显示，液泡膜蛋白8（vacuole membrane protein 8，Vac8）增强自噬活性，促进精子变形过程中胞质核糖体的自噬降解，从而为长形精子的运动提供能量。

ATG参与了许多与精子命运有关的重要事件，如睾酮等性激素的产生、外质特化结构组装、顶体发生和父系线粒体消除等[35]。Atg7-/-雄鼠不育并伴有异常顶体形成，类似于人类圆头精子症[36]。特异性敲除雄性生殖细胞中的Atg5会损害自噬流（autophagic flux），导致顶体发生缺陷、线粒体重排、过多细胞质和残余体（residual bodies）的保留，因此小鼠的生育力显著下降。精子超微及结构分析显示Atg5-/-小鼠附睾尾精子头部呈圆形、肿胀、弯曲或双头畸形，顶体形成异常，精子活力显著下降[1]。

沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性酶，通过对多种底物进行脱乙酰化而在许多生物过程中起重要作用[37]。SIRT1在细胞核中对微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）的脱乙酰化作用使LC3重新分布到细胞质，从而介导LC3的核质运输，这对于自噬小体的形成是必不可少的[38]。Liu等[2]研究发现，生殖细胞特异性Sirt1-/-雄性小鼠几乎完全不育，精子头部形态异常，顶体结构缺陷，进一步研究表明，在精子发生过程中，SIRT1通过对LC3去乙酰化而介导LC3的核质运输，LC3进入细胞质后立即被ATG7激活，然后转移到高尔基体衍生的小泡中，促进顶体生物发生。总体而言，自噬相关蛋白影响精子顶体发生的研究相对较少，分子机制有待于进一步阐明。

6 结语

近年全球男性不育症的发病率逐年升高，精子异常是男性不育的主要原因。受精是一个复杂而精细的过程，精子与卵子相遇后，与卵子透明带上的特异性蛋白相互作用，诱发顶体反应，与卵子融合最终完成受精过程。作为精子细胞特有的结构，顶体是成功受精的关键所在。顶体不同发育阶段受多种不同的蛋白调控，顶体发育相关蛋白在精子发生和男性不育症的发生发展中发挥着重要作用，顶体结构和功能障碍引起受精失败而导致男性不育。近年来随着高通量测序技术和敲除小鼠模型的广泛应用，已鉴定出许多精子顶体发育异常相关不育症致病基因，并揭示了其在精子发生和不育症中的重要作用及相关机制，但其精确分子调控机制尚未完全阐明。未来需要更多的研究来证实已发现的基因是否是人类不育的致病基因，并且对相关蛋白在人类生育中的作用进行有针对性的研究。对顶体发育相关蛋白在不育症中作用的深入研究能够在一定程度上解释不育症的发病机制，为男性不育的诊断和治疗提供新的思路。此外，对相关过程的干预将为新型避孕方法的开发提供依据。