饮用水中铜绿假单胞菌定量检验盲样考核结果与分析

张 华，姜 庆，李 杰，吴 迪，张 新

（临沂市检验检测中心，山东临沂 276000）

铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，为需氧、无芽孢、有运动能力以及乳糖非发酵革兰染色阴性杆菌，是一种常见的条件致病菌，常见于各种感染性疾病，如尿路感染、呼吸系统感染、软组织感染和各种全身感染，尤其是在烧伤患者和免疫缺陷患者中[1-2]。铜绿假单胞菌在自然界分布广泛，能够适应不同环境，且代谢多样，涵盖范围广泛，包括土壤、水（热水浴缸、水槽、水龙头、呼吸机和消毒水）、植物及动物、空气及其他富含水的场所（游泳池）[3-5]。

饮用水微生物污染是一个常见问题，对公众健康有着严重的影响。铜绿假单胞菌是一种重要的条件致病菌，常在饮用水中检测到。此外，人们越来越重视桶装饮用水和矿泉水的铜绿假单胞菌污染情况。近些年来，国内外对桶装水或瓶装水中检测出铜绿假单胞菌的情况报道日益增多，桶装饮用水中铜绿假单胞菌不合格率大于10%[6-7]。

我国最新饮用水标准《食品安全国家标准 包装饮水》（GB 19298—2014）中微生物限量规定，按照二级采样方案，同一批次的5份水样品要求每份水样品里不得检出铜绿假单胞菌。如果检出，则判定为不合格[8]。因此，铜绿假单胞菌检测在食品安全检验中具有重要意义。盲样考核是为了保证各级食品安全承检机构检测结果准确可靠，提高检验检测水平，并以监督和考核为目的的测评活动。临沂市检验检测中心参加了2022年由山东省市场监督管理局组织的盲样考核活动，检验项目为“饮用水中铜绿假单胞菌定量检验”，结果为满意。为提高实验室工作质量，总结经验，本文对实验过程及结果进行分析。

1 材料与方法

1.1 样品

收到编号为TL048的铜绿假单胞菌质控样冻干粉1瓶，在棕色西林瓶内有白色粉末状样品，避光储存于-20 ℃；样品中的菌含量为0～1.0×106CFU/250 mL；实验标准菌株：阳性对照菌株为铜绿假单胞菌标准菌株（CICC21636），阴性对照菌株为荧光假单胞菌标准菌株（CICC21620），从中国工业微生物菌种保藏管理中心采购。

1.2 培养基

假单胞菌琼脂基础培养基（CN平板）、营养琼脂（NA）、乙酰胺肉汤和绿脓菌素测定培养基，以上培养基都在保质期内，从北京陆桥股份有限公司采购；VITEK2 GN卡，法国生物梅里埃公司。

1.3 仪器设备

VITEK2 compact全自动微生物分析系统，法国生物梅里埃公司；AC2-4S1生物安全柜，新加坡ESCO；ZGP-2270隔水式恒温培养箱，上海智诚公司；ZF-2型三用紫外仪，上海安亭电子仪器厂；MLS3780高压蒸汽灭菌器，日本三洋公司；HTY-2000B集菌仪，杭州泰林生物技术设备有限公司；0.45 μm薄膜过滤器，北京牛牛基因技术有限公司；微量移液枪，Gilson公司。

1.4 实验方法

1.4.1 样品溶解

按照作业指导书，取出盲样考核样品并在室温下放置5 min，在生物安全柜内将铜绿假单胞菌质控品的瓶子打开，样品开启后加入5 mL灭菌去离子水溶解混匀，然后转移至装有980 mL灭菌去离子水的三角瓶中。随后，样品瓶中再加入5 mL灭菌去离子水进行润洗，润洗液转移至该三角瓶，润洗步骤重复3次。最终可得到1 L原液。

1.4.2 样品稀释

250 mL原液用于直接检测，剩余原液用于10倍系列稀释后检测。10倍系列稀释方法是取100 mL原液加入900 mL灭菌去离子水，混匀得到稀释10倍的样品稀释液，以此方法稀释到10-4。

1.4.3 样品过滤

样品在100级的洁净工作台进行过滤操作。首先将0.45 μm孔径的薄膜过滤器固定在集菌仪上，然后开始抽吸水样，等滤膜湿润后，将薄膜过滤器通气孔关闭，开始过滤。薄膜过滤器内水样完全过滤后，使用无菌镊子小心地从滤膜边缘将过滤后的滤膜夹起，平铺到CN琼脂平板上，集菌的滤膜面朝上。

1.4.4 培养

把CN平板倒置，放置于培养箱内，（36±1） ℃培养24～48 h。在培养过程中勤于观察，可分别在20～24 h和40～48 h观察滤膜上菌落的生长情况及计数。同时做阳性和阴性对照[9]。

2 结果与分析

2.1 CN平板观察与计数

按照盲样作业指导书和《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2016）操作，从原液至10-4稀释度进行取样检测，TL048样品在原液、10-1、10-2稀释度的平板中只生长出一种特征的典型菌落，为绿色菌落，没有其他可疑菌落生长，结果见表1。

表1 CN平板上计数结果表

2.2 确证性实验

TL048考核样品在稀释10倍的CN平板上只生长绿色菌落。在暗室中，将紫外仪波长365 nm的开关打开，紫外灯照CN平板，发现绿色菌落产荧光，注意不可长时间紫外灯照射，以免影响菌落生长。将绿色菌落转接到绿脓菌素斜面培养基上，进行绿脓菌素抽提实验，结果显示绿脓菌素实验结果为阳性，则判定该绿色菌落是铜绿假单胞菌。同时，使用VITEK2进行生化鉴定，鉴定结果显示99%为铜绿假单胞菌。最终菌落计数为2.6×102CFU/250 mL，见表2。

表2 鉴定结果表

3 结论与讨论

本次盲样考核样品，饮用水中铜绿假单胞菌定量检验在CN平板计数报告结果为2.6×102CFU/250 mL，Z值小于2，评价结果满意。由此可见该实验室具备铜绿假单胞菌定量检测的能力。

自2019年以来，《国家食品安全监督抽检实施细则》将铜绿假单胞菌指标作为包装饮用水的重点监测项目之一。目前《食品安全国家 包装饮用水》（GB 19298—2014）标准要求的铜绿假单胞菌检验项目为定量检验，按照二级采样方案，每批次5份水样品，每份水样都不得检出（0 CFU/250 mL），如检出，则判定为不合格，由此看出，铜绿假单胞菌的定量检测是实验室进行质量控制的一项重要项目。所以，在进行盲样考核等实验过程中，以下问题应该引起人们的注意。①实验前认真阅读作业指导书，作业指导书对本次盲样考核的样品、实验方法、结果记录等有特别要求。例如，本次盲样考核要求样品每个稀释度做2个平行，按照作业指导书进行梯度稀释，而《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水》（GB 8538—2018）检验方法中未有明确要求。②实验前做好准备工作，包括仪器设备的校准、试运行以及培养基试剂是否齐全。有条件的实验室可以购买质控样品进行预实验，提前发现问题并进行解决。③定量检测项目一般在作业指导书中表明样品含量水平，可多做几个稀释度，确保结果准确。④保持CN平板表面干燥，防止菌落蔓延生长，将过滤膜贴在平板上时要保持平整，不能留有空隙，避免后续影响铜绿假单胞菌计数。⑤铜绿假单胞菌在生化鉴定时，由于国标方法检测耗时较长，可借助VITEK2鉴定仪辅助鉴定，进而提高鉴定效率。⑥铜绿假单胞菌在培养48 h后，菌落生长较大，容易连成片，不易观察计数。因此，可在培养20～24 h和40～48 h后分别观察滤膜上菌落的生长情况。⑦按照作业指导书进行样品梯度稀释时，若样品总体积为1 L，则应选取2 L的三角瓶或无菌均质袋，确保水样能够彻底混合均匀。⑧铜绿假单胞菌为条件致病菌，实验所用的量筒、三角瓶和薄膜过滤器等应121 ℃高压灭菌30 min以上，按照规定处理，防止污染环境。