食源性致病菌混合菌种的分离鉴定

张春鹏 马妍娜 李媛 王波

摘要：依据食品安全国家标准GB 4789现行有效的微生物检验方法及CNAS评审专家提供的混合菌种鉴定作业指导书，对食源性致病茵混合茵种进行了实验室比对实验。结果表明：盲样样品中检出鼠伤寒沙门氏茵（1，4.[5]，12：i：1，2）和阪崎肠杆茵。此次混合茵种鉴定项目取得了满意的实验结果，通过考核可以确保日常检测结果准确可靠。

关键词：混合菌种;鉴定;食源性致病茵;盲样

中图分类号：X959 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）18-0127-03

1引言

食品微生物实验室质量控制包括内部质量控制和外部质量评估。实验室内部质控是实验室自我控制质量的常规程序，可以反映检验质量稳定性状况，及时发现分析中异常情况。室内质量控制是从实验室的人员、方法、试剂、设备、标准、环境等环节进行严格的质量控制，减少主观因素对检验结果的影响，以保证检验结果的准确性。实验室外部的质量考核是对实验室人员技能和实验室内部质量控制的检验。混合菌种鉴定是检测实验室能力验证和实验室间比对的常用方法，可以验证检验人员的检验能力，发现实验室内部不易发现的潜在问题。

2材料与方法

2.1样品来源

样品来自中国合格评定国家认可委员会（CNAS）专家提供的盲样样品1支，以西林瓶胶塞铝盖封口，内含待测菌的冻干粉。盲样有2种致病菌，最终结果应报出所有检出菌种的名称（如进行血清学试验，菌种名称应包含血清型，沙门氏菌报告相应的群抗原即符合）。

2.2培养基及试剂

商品培养基和生化鉴定试剂盒购自广东环凯微生物科技有限公司;沙门氏菌诊断血清（60种）购自宁波天润生物药业有限公司;质控菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心;革兰氏阴性和阳性细菌鉴定卡购自法国梅里埃公司。均在有效期内使用。

2.3仪器与设备

HVE-50高压灭菌器，日本Hirayama;LA2-6AI生物安全柜，新加坡艺思高;SPX-300BSH-II生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司;DG250厌氧培养箱，英国DWS;BX41荧光显微镜，日本奥林巴斯;VITEK2全自动微生物鉴定系统，法国梅里埃。均性能良好，检定校准均在有限期内。

2.4检测方法

采用食品安全国家标准GB 4789现行有效的微生物检验方法及CNAS评审专家提供的混合菌种鉴定作业指导书。

3结果与分析

3.1增菌与分离

无菌开启西林瓶，加入少量脑心浸出液肉汤（BHI）进行再水化，待溶解后，接种到两瓶100mL BHI肉汤培养基中，一瓶放人生化培养箱，36℃培养24h，另一瓶放入厌氧培养箱，36℃培养24h，结果两瓶增菌液均混浊。用接种环分别接种EMB琼脂平板、血琼脂平板、Baird-Parker琼脂平板、哥伦比亚CNA血琼脂平板、TCBS琼脂平板、MYP琼脂平板、HE琼脂平板、BS琼脂平板、XLD琼脂平板、沙门氏菌属显色琼脂平板、CT-SMAC琼脂平板、大肠埃希氏菌0157显色琼脂平板、阪崎肠杆菌显色琼脂平板、CN琼脂平板、MAC琼脂平板、PALCAM琼脂平板、李斯特氏菌显色琼脂平板，观察菌落特征。在阪崎肠杆菌显色琼脂平板、HE琼脂平板、BS琼脂平板、XLD琼脂平板和沙门氏菌属显色琼脂平板发现2种可疑致病菌菌落，编为1号菌和2号茵，菌落特征见表1。

3.2生化试验和血清学鉴定

自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上可疑菌落，接种三糖铁琼脂和营养琼脂平板，于36℃±l℃培养18h～24h，观察三糖铁琼脂培养基内的反应结果，同时做革兰氏染色，结果见表2E2.33。

根据选择性琼脂平板上的菌落特征，三糖铁试验和革兰氏染色结果，1号菌和2号菌分别继续做沙门氏菌和阪崎肠杆菌相关生化试验。

1号菌典型生化反应可判定为沙门氏菌茵属，结果见表3。进行血清凝集试验，以生理盐水做对照，结果为鼠伤寒沙门氏菌（1，4，[5]，12：i：1，2）。采用VITEK2全自动微生物鉴定系统进行分析，同时以沙门氏菌做阳性对照，大肠埃希氏菌为阴性对照，生化结果显示该菌为沙门氏菌，阴性对照和阳性对照结果完全符合。

2号菌生化试验结果可判定该菌为阪崎肠杆菌，结果见表4。以阪崎肠杆菌和大肠埃希氏菌为阳性和阴性对照，通过全自动微生物鉴定系统对比实验结果，提示该菌为阪崎肠杆菌。

综合上述结果，该份盲样中检出鼠伤寒沙门氏菌（1，4，[5]，12：i：1，2）和阪崎肠杆菌，与CNAS评审专家结果一致，取得了满意的结果。

4结语

致病菌是常见的致病性微生物，能夠引起人或动物疾病。食品中的致病菌中主要有沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌0157：H7、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌和志贺氏菌。随着食品工业的发展和产品的快速流通，由食品引起的食源性疾病成为全球关注的重要食品安全问题。食源性致病菌引起的食物中毒不断发生，引起各国政府的高度重视，因此增强检测能力对食品中致病菌的风险防控具有重要的意义。

接收盲样样品时应认真检查样品的状态，有无破损情况，有异常情况及时与组织部门沟通，核实后再进行实验。由于本次考核目标菌未知，进行鉴定时要考虑各种致病菌的菌落特征，这就需要平时工作中多积累经验，并且有扎实的基本功。增菌及分离培养基配制在盲样考核中至关重要，在检验中要充分利用现有的显色培养基和生化培养基的特性，应选择尽可能多的选择性平板进行接种，在发现可疑菌落时，应尽量多挑取可疑菌落进行鉴定，避免漏检。有时也要对菌落特征不太明显的菌落进行鉴定，比如有的沙门氏菌在XLD琼脂平板上呈现黄色菌落并且不带黑色中心，这与大肠埃希氏茵菌落相似，因而容易在检测过程中漏检。平板在使用前应无明显的水珠，潮湿的平板可能会导致菌落扩散蔓延，影响分离效果。

微生物混合菌种盲样考核为实验室提供有效的外部质量控制，改善实验室质量管理，提高检验人员技术技能。特别是CNAS评审专家现场提供盲样测试，可以直接展示实验室的技术能力，有效地补充和支持评审专家的评审工作，证实实验室对程序、方法和其他运作的有效控制。参加CNAS组织的微生物检测能力考核，有利于检验人员掌握微生物检验的理论知识和实操技能，提高实验室能力的可信度，促进实验室检测能力的不断提高。