脑心通胶囊对大鼠心梗后心室重构的影响研究*

伍啟华 蔡海荣 赵 帅 刘淑玲 张为章 陈伯钧，，3，4 曾 靖，3，4△

（1.广州中医药大学，广东 广州 510004；2.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510120；3.广东省中医急症研究重点实验室，广东 广州 510102；4.广州中医药大学第二附属医院中医药防治心血管急症临床研究团队，广东 广州 510006）

急性心肌梗死是冠状动脉堵塞导致心肌缺血缺氧，引起心肌细胞大量坏死、凋亡的疾病。心肌梗死由于神经内分泌因子分泌而导致心室重构，进而引起心脏收缩和舒张功能的改变，最终进展为慢性心力衰竭［1］。心力衰竭是各种心血管疾病的终末期，5年病死率高达52.6%［2］，已经超越肿瘤。据统计，我国目前现有冠心病患者1 100万，心力衰竭患者890万［3］，心肌梗死已经成为心力衰竭最主要的原因，而心力衰竭是心肌梗死患者死亡的主要原因。心室重构是指心肌细胞凋亡、坏死、自噬、增生，继发细胞外基质改变，最终引起心肌纤维化。因此，有效治疗心室重构对改善心肌梗死患者的预后具有重要的意义。

氧化应激是心室重构的重要启动基质，还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶（NOX）主要存在于心肌组织中，心肌梗死后心肌细胞凋亡、坏死可以促进NOX表达上升，进而导致活性氧（ROS）分泌增加、堆积，产生细胞毒性，引起心室重构［4-5］。LXRα是配体依赖性的核受体超家族成员，在胆固醇转运、动脉粥样硬化、心肌肥厚、心肌纤维化等方面具有重要的作用［6］。本课题组前期基础研究表明，脑心通胶囊可以减少心肌梗死面积和改善心功能［7-9］，但是对心梗后心室重构的作用尚未明确。因此，本研究复制了大鼠心肌梗死后心室重构模型，给予脑心通胶囊干预，观察脑心通胶囊对心梗后心室重构的改善并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠40只，5～6周龄，体质量（200±10）g，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2018-0002。饲养于广州中医药大学实验动物中心，饲养环境：光照和黑暗每天各12 h，温度19～27℃，湿度50%～70%，通风换气每8～12小时1次。

1.2 药物与试剂 1）药品：脑心通胶囊［规格：0.4 g/粒，陕西步长制药有限公司，国药准字Z20025001］，阿托伐他汀钙片（规格：10 mg/粒，辉瑞制药有限公司，国药准字J20171062）。2）试剂：Masson染液套装（武汉纯度生物科技有限公司，货号DC389）；Trizo（lMRC，货号Invitrogen）；M-MLV Reverse Transcriptase（Promega，货号M3682）；GoTaq（R）qPCR Master Mix（Promega，货号A6100）；中性树胶（北京凯瑞基生物科技有限公司，货号87226）；苏木素染液（广州威佳科技有限公司，货号G1080）。

1.3 实验仪器 动物呼吸机（南京卡尔文生物科技有限公司）；成像系统［徕卡显微系统（上海）贸易公司］；倒置荧光显微镜［徕卡显微系统（上海）贸易公司］；紫外可见分光光度计（武汉纯度生物科技有限公司）；紫外透射分析仪（太仓市华利达实验设备有限公司）；基因扩增仪（Hema）；Real-time Quantitative PCR（Bio-Rad）。

1.4 模型制备 大鼠经2.5%阿佛丁腹腔注射麻醉后固定于手术台上，胸腹部和颈部备皮。碘伏消毒颈部皮肤后沿颈部中线剪开皮肤，分离肌肉和甲状腺，暴露气管，将气管导管插入大鼠气管中，调整呼吸机频率、潮气量、呼吸比等。然后用碘伏消毒胸部皮肤，横向剪开大鼠左侧乳头下方2 cm处的皮肤，分离肌肉至胸膜，剪开胸膜，暴露心脏，胸腔内放置棉球固定心脏。寻找左心耳后确定冠状动脉左前降支的位置，用5-0缝合线缝扎左前降支，结扎后可见左心室变白，室壁运动减弱。关闭胸腔，注射器抽吸胸腔积液和积气，逐层缝合肌肉和皮肤。断开呼吸机，缝合颈部皮肤。假手术组只开胸不结扎冠状动脉左前降支。1周后行Doppler超声检测，若左心室射血分数（EF）＜40%则判定为心肌梗死后心室重构模型构建成功。

1.5 分组和给药 将心肌梗死后心室重构模型构建成功大鼠随机分为模型组、脑心通组、他汀组。按照《药理实验方法学》［10］计算大鼠药物剂量，他汀组给予阿托伐他汀钙片20 mg（/kg·d）灌胃，脑心通组给予脑心通胶囊378 mg（/kg·d）灌胃，模型组和假手术组给予等体积的生理盐水灌胃，灌胃时间为4周。

1.6 指标检测 1）心脏超声检测：在灌胃4周结束后，采用Doppler超声检测大鼠的心功能，包括左室舒张末期内径（LVDd）、左室收缩末期内径（LVDs）、左室射血分数（LVEF）、短轴收缩率（FS）、每搏输出量（SV）、心排血量（CO）。2）QPCR检测心肌组织LXRα mRNA、NOX mRNA、COLⅠmRNA、COLⅢ mRNA的表达：心脏超声检测结束后，大鼠腹腔注射麻醉剂，剪开胸腔，剪取心脏组织，保存于-80℃冰箱。检测时提取心室总RNA，逆转录合成cDNA，以GAPDH为内参，进行QPCR扩增试验，检测各因子mRNA表达水平。引物序列采用Primer Express5.0设计，引物序列如下。LXRα上游引物：TGATGTTCCCACGGATGCTA，下游引物：GCCAACACAGAGGACACGG；NOX2上游引物：CAGGA TGGAGGTGGGACAA，下游引物：GTCGCCAACAATG CGGATA；COI上游引物：GCCCAGTTTGGTATCAAA GGT，下游引物：AAAAGGAACATTTGCTGGTCT；COⅢ上游引物：GCCTCCCAGAACATTACATACC，下游引物：CCAGTGTGTTTAGTGCAGCCAT。QPCR扩增试验结束后，检测各样本的Ct值，然后计算相对表达量。3）ROS检测：采用 DCFH-DA（2，7-Dichlorofuorescin Diacetate）探针检测心肌组织ROS的相对荧光度。4）HE染色：剪取心脏组织用甲醛固定后，脱水机脱水，石蜡包埋，切片机切片，烘箱内烤片，脱蜡，苏木素和伊红染色，脱水封片，置于显微镜下观察。5）Masson染色：心肌组织制成石蜡切片后脱蜡，分别重铬酸钾、铁苏木素、丽春红酸性品红染色、磷钼酸染色、苯胺蓝染色，分化，透明封片，显微镜下观察。

1.7 统计学处理 应用SPSS26.0统计软件。计量资料以（）表示，组间采用单因素方差分析，两两间比较采用LSD-t法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织HE染色结果 见图1。HE染色示假手术组大鼠心肌结构正常；模型组大鼠可见大量增生的纤维结缔组织和炎性细胞浸润；脑心通组和他汀组大鼠心肌纤维结缔组织减少，炎性细胞浸润较轻，正常心肌细胞较模型组多。

图1 各组大鼠心肌组织（HE染色，200倍）

2.2 各组大鼠心肌组织Masson染色结果 见图2。Masson染色示假手术组大鼠心肌结构正常，无纤维化组织；模型组大鼠可见胶原纤维结缔组织增生；脑心通组和他汀组大鼠胶原纤维结缔组织增生较模型组轻。

图2 各组大鼠心肌组织（Masson染色，100倍）

2.3 各组大鼠心功能指标比较 见表1。灌胃4周结束后，与假手术组比较，模型组大鼠LVIDd、LVIDs升高，LVEF、FS、SV、CO降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，脑心通组大鼠LVIDd、LVIDs降低，LVEF、FS、SV、CO升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠心功能指标比较（±s）

表1 各组大鼠心功能指标比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别假手术组模型组脑心通组他汀组n 10 10 10 10 LVIDd 5.96±0.30 9.20±0.79*6.67±0.49△6.53±0.37△LVIDs 3.67±0.39 7.57±0.91*4.32±0.32△4.03±0.23△LVEF 61.92±3.53 26.54±4.86*53.93±5.26△57.90±3.41△FS 35.17±2.21 16.35±1.81*31.60±2.62△32.89±2.36△SV 130.33±4.10 92.09±3.33*121.34±7.24△124.72±5.78△CO 53.38±7.16 32.86±7.24*42.89±4.92△48.74±6.45△

2.4 各组大鼠心肌LXRα、NOX、COLⅠ、COLⅢmRNA和ROS表达水平比较 见表2。灌胃4周结束后，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织LXRα mRNA表达降低，NOX、COLI、COLⅢ mRNA表达水平和ROS活性增加，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，脑心通组大鼠心肌组织LXRα mRNA表达增加，NOX、COLI、COLⅢmRNA表达水平和ROS活性降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠心肌LXRα、NOX、COLI、COLⅢmRNA和ROS表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠心肌LXRα、NOX、COLI、COLⅢmRNA和ROS表达水平比较（±s）

组 别n LXRα mRNA NOX mRNA ROS COLI mRNA COLⅢmRNA假手术组模型组脑心通组他汀组10 10 10 10 1.02±0.10 0.37±0.08*0.87±0.10△1.05±0.30△1.02±0.10 3.25±0.27*1.11±0.15△0.94±0.07△1.01±0.08 3.10±0.37*1.25±0.17△1.11±0.12△1.09±0.17 2.98±0.27*1.13±0.18△0.83±0.15△1.00±0.13 3.16±0.21*1.22±0.23△0.89±0.13△

3 讨论

心肌梗死属于中医学“胸痹”范畴，中医学认为气虚血瘀是心肌梗死后心室重构的核心病机［11］。《素问·痹论》曰“心痹者，脉不通……倘若心阳不振，则搏动无力，致血行缓滞而积瘀”。气与血相互为用，气为血之帅，气行则血行，心肌梗死患者多为中老年人群，正气亏虚，心气不足，心主血脉，心气虚则无力推动血行，血行瘀滞，瘀血内生，痹阻血脉，不通则痛；且瘀血为有形之邪，瘀血留滞心络、心肌，随着病程进展，瘀血日渐堆积，引起血管狭窄、增生和心肌增厚等。因此，心肌梗死后心室重构应以益气活血为法则。脑心通胶囊出自补阳还五汤，方中黄芪重用为君，补气益气，气足则心脉通畅，心有所主。地龙活血通络，全蝎息风通络，水蛭破血消癥，3药合用为臣，活血化瘀，通络止痛。川芎为血中之气药，理气活血；牛膝活血化瘀；当归、鸡血藤补血活血，活血不伤正；红花活血痛经；桃仁活血化瘀；赤芍凉血活血；丹参活血化瘀、清心除烦。8味药合用为佐，加强活血化瘀功效。桂枝温阳通经，桑枝通经络，二药合用为使药，引药入心络、血脉。诸药合用，共奏益气活血功效。已有研究发现，脑心通胶囊具有减少心肌梗死面积和改善心功能的作用［7-8］。

心肌梗死后心力衰竭的发生率为25%［12］，一旦出现心力衰竭，心肌梗死患者的病死率明显升高。心室重构是心肌梗死发生心力衰竭的重要机制，主要表现为心肌细胞凋亡、坏死、自噬、纤维化，进一步导致心室壁增厚和心腔扩大，LVEF下降。HE染色可以显示心肌组织形态结构、心肌细胞排列循序和纤维化等，Masson染色可以直接显示心肌组织胶原纤维增生的程度。本研究结果显示，假手术组大鼠心肌细胞排列有序，未见纤维化和炎性细胞浸润等病理改变；模型组大鼠正常细胞心肌细胞大部分消失，代之以增生的纤维细胞，并可见炎性细胞浸润，提示模型组大鼠出现了心室重构。而经过脑心通胶囊干预后大鼠正常心肌细胞增多，心肌纤维化程度减轻。Masson染色示假手术组大鼠心肌组织无胶原纤维增生，模型组大鼠可见大量胶原纤维增生，而脑心通胶囊干预后心肌组织胶原纤维减轻。提示脑心通胶囊可以减轻心肌梗死后心室重构大鼠的纤维化。

心肌梗死后心室重构会出现心力衰竭，心功能是临床上重要评价指标。心室重构患者心室壁增厚，心腔增大，故LVIDd和LVIDs增大，而心肌收缩能力下降，故LVEF、FS、SV、CO均降低。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠LVIDd、LVIDs升高，EF、FS、SV、CO降低；经过脑心通胶囊干预后，大鼠LVIDd、LVIDs降低，EF、FS、SV、CO升高。提示脑心通胶囊可以抑制心肌梗死后心室重构和改善心功能。

LXRα是配体依赖性的核受体超家族成员，在调节胆固醇转运、动脉粥样硬化、炎症反应方面均起到重要的作用。有研究指出，LXRα基因敲除小鼠出现心肌细胞凋亡、坏死、纤维化，减少心脏血管新生，从而加重心室重构［13］。氧化应激也是心室重构的重要机制，氧化应激主要是氧化应激物质产生过多或机体抗氧化能力不足，导致ROS堆积，产生细胞毒性，引起心肌细胞凋亡、坏死、胶原纤维增生和纤维化，发生心室重构。NOX2是ROS生成的主要来源，NOX2主要存在于心肌细胞中，心肌梗死后心肌分析大量NOX2，催化大量ROS生成，引起氧化应激损伤［14］。细胞外基质是心肌细胞外的主要成分，主要包括胶原和成纤维细胞。心肌梗死后ROS可以激活金属基质酶家族，促进成纤维细胞分泌大量的Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维，导致心肌纤维化和疤痕形成［15］。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌LXRα mRNA表达降低，NOX、COLI、COLⅢmRNA表达水平和ROS活性增加；脑心通胶囊干预后大鼠心肌LXRα mRNA表达升高，NOX、COLI、COLⅢmRNA表达水平和ROS活性下降；提示脑心通胶囊可以上调LXRa mRNA的表达，抑制NOX、COLI、COLⅢmRNA的表达水平和ROS活性。

综上所述，脑心通胶囊可能通过上调LXRα mRNA，抑制NOX、COLI、COLⅢ mRNA的表达和ROS活性，从而延缓心肌梗死后心室重构。