UPLC-MS/MS 法测定橘红颗粒中贝母素甲与贝母素乙的含量

袁杨秀，钟英，周云峰

1.袁州区妇幼保健院，江西 宜春 336000；2.宜春市检验检测中心，江西 宜春 336000

橘红颗粒是由化橘红、陈皮、法半夏、浙贝母等15 种药味组成的中药复方制剂［1］，主治胸闷口干、痰多、痰热咳嗽、色黄黏稠等症［2］，乃临床上用于清肺、化痰、止咳的重要良药。橘红颗粒方中浙贝母为佐药，具有清热化痰止咳的功效［3-5］。现行标准［1］只对该制剂中的浙贝母进行了定性鉴别，但在无法知悉其真实投料的情况下，难以甄别少投料、掺伪等行为，因此有必要对其含量进行分析。鉴于橘红颗粒的现行标准无浙贝母的含量测定项，本研究对橘红颗粒的质量标准进行提升，采用超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）建立浙贝母药味中贝母素甲和贝母素乙的含量测定方法，报告如下。

1 仪器与材料

沃特世H-class 超高效液相系统（美国waters公司）；沃特世xevo TQD 三重串联四级杆质谱系统（美国waters 公司）；KH-250DB 超声波清洗仪（昆山禾创超声仪器有限公司）；Molelement1820D 纯水机（重庆摩尔水处理设备有限公司）。

橘红颗粒样品（市售10 批，来源于8 个厂家，规格均为11 g/袋，其他信息见表2）；贝母素甲对照品（批号：110750-201913，纯度：98.4%）和贝母素乙对照品（批号：110751-201712，纯度：97.7%）购于中国食品药品检定研究院；缺浙贝母的阴性样品（自制）；乙腈、甲醇和甲酸为色谱纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱、质谱条件

超高效液相系统：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC ® BEH C18 柱；柱温25 ℃；以0.1%甲酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，流速0.3 mL/min，梯度洗脱（0～2 min，10%B；2～10 min，10%→45%B；10～14 min，45%→75%B；14～15 min，75%→10%B；15～18 min，10%B）；进样量5 μL。三重串联四级杆质谱系统：电喷雾离子源ESI；正离子电离模式（+）；多反应监测模式（MRM）；雾化气流量900 L/h；锥孔气流量50 L/h；干燥气温度550 ℃；毛细管电压0.70 kv；贝母素甲检测离子对m/z432.0 →414.0（定量），m/z432.0 →98.0；贝母素乙检测离子对m/z430.2 →412.3（定量），m/z430.2 →98.0。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取贝母素甲、贝母素乙对照品适量，加甲醇溶解配成含贝母素甲183.811 2 ng/mL、贝母素乙224.905 4 ng/mL 的对照品混合母液。

2.3 供试品溶液的制备

取装量差异项下的样品，研细，取约1 g，精密称定，置于100 mL 量瓶中，加入80 mL 0.1%氨水的80%甲醇溶液，超声处理20 min，放至室温，用0.1%氨水的80%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

精密量取对照品混合母液适量，加甲醇稀释配制成含贝母素甲3.676 2 ng/mL、9.190 6 ng/mL、18.381 1 ng/mL、27.571 7 ng/mL、36.762 2 ng/mL、91.905 6 ng/mL、183.811 2 ng/mL 和贝母素乙4.498 1 ng/mL、11.245 3 ng/mL、22.490 5 ng/mL、33.735 8 ng/mL、44.981 1 ng/mL、112.452 7 ng/mL、224.905 4 ng/mL 一系列浓度的对照品溶液，按照2.1 项下色谱、质谱条件，测定不同浓度对照品的峰面积。以对照品浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算得出贝母素甲的回归方程为Y=3 659.9X-2 409.8，r=0.999 9；贝母素乙的回归方程为Y=8 448.9X+55 588，r=0.993 3。

2.5 专属性试验

为验证其他药味对浙贝母含量测定无干扰，以缺浙贝母药味的实验室自制橘红颗粒按“2.3”项下处理方法制备阴性样品溶液，与供试品溶液、对照品溶液依次进样测定。结果可知，供试品溶液检出与贝母素甲和贝母素乙对照品溶液保留时间一致的离子峰，而阴性样品溶液在与对照品相应的保留时间上未出现离子峰，说明制剂中其他药味对该含量测定无干扰，方法的专属性较好，见图1。

2.6 精密度、重复性、稳定性试验

取一份混合对照品溶液（贝母素甲浓度为18.381 1 ng/mL，贝母素乙浓度为22.490 5 ng/mL），连续进样6 次，记录峰面积，贝母素甲和贝母素乙的峰面积RSD 分别为2.0%和0.6%；平行称取6 份样品（批号：20210305），制备供试品溶液，测定含量，贝母素甲和贝母素乙的RSD 为2.5%和1.5%；取重复性项下的一份供试品溶液，在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h 测定峰面积，贝母素甲和贝母素乙的RSD 分别为2.6%和1.4%。说明该方法精密度、重复性、稳定性良好。

2.7 加标回收试验

称取6 份样品（批号：20210305），每份约0.5 g，精密称定，置于100 mL 量瓶中，精密加入混合对照品溶液10 mL（贝母素甲浓度为0.137 9 μg/mL，贝母素乙浓度为1.124 5 μg/mL），再加入0.1%氨水的80%甲醇溶液适量，按“2.3”项下方法制备加标样品溶液，依次测定，回收率见表1。

表1 加标回收率

2.8 样品结果

取不同厂家不同批号的样品，分别按照“2.3”下方法制备供试品溶液，按上述色谱、质谱条件测定峰面积，代入回归方程计算含量，结果见表2。

表2 橘红颗粒中贝母素甲和贝母素乙含量结果（n=2）

3 讨论

贝母素甲和贝母素乙为甾体类生物碱［6-7］，在紫外光区无吸收［8］，其含量一般采用高效液相色谱-蒸发光散射法进行分析［1,9-12］。但考虑到该法灵敏度较低，样品前处理较为烦琐，且橘红颗粒中浙贝母投料占比较低，本研究采用UPLC-MS/MS 法测定橘红颗粒中贝母素甲和贝母素乙的含量。液相系统选择乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相，贝母素甲和贝母素乙采用等度洗脱其离子峰会互相干扰，后采用梯度洗脱程序，二者可在色谱柱中有效分离；质谱系统选择电喷雾离子源、正离子电离和MRM采集模式，在该条件下贝母素甲和贝母素乙均具有较高的信号响应。

贝母素甲定量检测离子对为m/z432.0 →414.0，贝母素乙定量检测离子对为m/z430.2 →412.3，其裂解规律为在正离子电离模式下，贝母素甲的母离子为m/z432.0［M+H］+，失去一分子H2O 得到子离子m/z414.0［M+H-H2O］+；贝母素乙的母离子为m/z430.2［M+H］+，失去一分子H2O 产生子离子m/z412.3［M+H-H2O］+。

贝母素甲和贝母素乙可溶于甲醇中［13］，但在植物或中药制剂中一般以盐的形式存在，采用甲醇直接提取橘红颗粒中的上述两种成分可能不能完全提取或需要较长时间，而加入一定量的氨水后可使其转为游离态［14］，有利于溶于有机试剂。考虑到颗粒制剂一般在水中能快速溶散溶解，样品提取溶剂最终选择0.1%氨水的80%甲醇溶液，经过超声20 min 后，贝母素甲和贝母素乙即可提取完全。

从橘红颗粒中贝母素甲和贝母素乙含量结果来看，不同生产企业的样品含量差异明显，其中贝母素乙最高量约为最低量的23 倍。分析原因可能是与浙贝母原料进货来源、采收季节、种植区域等不同有关，但也不排除企业对浙贝母质量控制把关不严甚至为了牟利出现少投料、药渣投料或掺伪等情况。

综上所述，所建立的UPLC-MS/MS 法能够快速准确测定橘红颗粒中贝母素甲和贝母素乙的含量，有助于控制该品种的质量，对于保障该品种用药安全有效性具有一定作用。