中药中黄曲霉毒素检测与脱毒技术研究进展

王燕，刘绪平，章红，段和祥，刘卫德，霍晓菲

1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

黄曲霉毒素（aflatoxins，AFT）为一组化学结构类似的真菌次级代谢产物，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）毒性最强、污染普遍，被列为Ⅰ级致癌物。研究表明，AFT 具有严重的肝毒性，甚至产生致畸、致癌和致突变等危害［1］。然而，中药在种植、采收、炮制加工、贮藏等各个环节都有可能出现AFT 污染，影响中药质量和临床用药安全［2］。近年来，中药的质量安全特别是中药中AFT 污染问题已经严重制约了我国中药现代化发展进程。因此，中药中AFT 检测及降解脱毒技术的研究迫在眉睫。本文在简要介绍中药中AFT 污染状况基础上，对AFT 国内外限量标准、AFT 检测技术及降解脱毒技术进行了归纳总结，以期为解决AFT 污染问题，保障中药质量提供思路。

1 黄曲霉毒素的污染与限量

中药污染AFT 与其自身基质和外部环境之间有着密切的关系。污染的方式复杂多样，可能发生在整个链条上，从鲜品到最终产品。从内部因素来看，某些中药基质为霉菌生长代谢提供充足营养，从而加剧AFT 污染程度，如脂肪油、糖类、蛋白质等基质成分。其中脂肪油含量高的中药最易受AFT 污染，其次则是富含糖类和蛋白质的中药［3］。然而富含挥发油的药材被证实具有抑制霉菌生长的作用，与其他中药材混合储存，可以提高其他中药的防霉能力，为中药防霉技术提供了新思路。从外部因素来看，光照、温度、水活度、营养物质、pH 值、氧化胁迫等环境因子都会对AFT 的合成产生影响［4］。

近年来，随着人们对AFT 的不断深入研究，为维护公众健康，保障用药安全，各国对中药中AFT进行了限量规定（表1）。

表1 各国药典对中药中的黄曲霉毒素限量标准 μg/kg

2 黄曲霉毒素检测技术

目前，仪器分析法和免疫学分析法是常用的AFT 检测技术。仪器分析法包含高效液相色谱法、液质联用法和表面增强拉曼散射法等，免疫学分析法有酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析技术和荧光免疫法等。然而，仪器分析法的样品前处理繁琐，仪器成本昂贵，且需要专业技术人员操作，难以满足即时检测要求；免疫分析法耗时耗财，且操作过程难以自动化。近年来，随着科技的不断创新和发展，胶体金免疫层析法、免疫芯片、免疫传感器等大批新检测技术层出不穷，这些新技术极大弥补了传统技术在即时检测和现场可视化等方面的短板，为中药中AFT 现场快速可视化等检测技术提供了有力支持。

2.1 薄层色谱法

薄层色谱法（TLC）是一种传统的化学分析方法，为最早应用于测定AFT 的经典方法之一。其原理是基于AFT 在紫外灯照射下具有荧光性，从而进行定性定量分析。此技术操作简便，成本低廉，但其前处理复杂，特异性差，灵敏度低，检测耗时，不能满足当下检测分析要求。

2.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）具有较高的检测分离多种真菌毒素效能，成为检测AFT 常用的方法之一。该技术原理是采用色谱柱分离技术，根据待测物分离的不同实际情况，通过测量色谱峰面积进行AFT 定量分析［6］。HPLC 法有多种衍生化方法，如柱前衍生、柱后光化学衍生及柱后碘衍生等。其中，柱后光化学衍生法的应用较为广泛。由于其不需添加衍生化试剂，可通过在线紫外线照射将无荧光性的AFB1和AFG1羟基化，使其具有荧光性，提高灵敏度，且不影响其他组分，进而可通过荧光检测器同时检测4 种AFT 成分。例如，王云霞等［7］采用HPLC-柱后光化学衍生法检测清火片（胶囊）中黄曲霉素G2、G1、B2、B1。该衍生化法还广泛应用于众多的动植物药材中，如莲子、柏子仁等［8-9］。HPLC-柱后碘衍生法在检测中药材中AFT 也有应用，如陈皮、三七粉等［10-11］。

2.3 液相色谱-质谱联用技术

液质联用技术（LC-MS）将液相色谱与质谱有效结合，实现优势互补［12］，能快速、准确地定性定量分析药材中痕量的AFT。罗朝权等［13］建立了一种即时检测动物类药材污染AFB1和AFG1的液质联用法，应用该法检测分析发现，土鳖虫等动物类药材受到黄曲霉菌严重污染。此外，随着技术的不断改进，研究者们从净化方式和联用仪器等方面入手，提出了更多优化方案，如刘震营等［14］采用IAC-HPLC-ESI-MS/MS 法测定柏子仁中的AFT。

2.4 免疫检测技术

免疫检测技术是抗原与抗体高度特异性识别的检测方法［15］，绿色无污染，在AFT 检测领域应用广泛。以下归纳总结了中药常用的AFT 免疫检测技术。

2.4.1 酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法（ELISA）应用抗原抗体的特异性反应和酶的高度专一性、高效催化作用，进而测定AFT 含量。该法可批量即时检测样本中的AFT，但在实际检测中，很容易受到重金属离子、脂肪及pH 等因素的干扰，可能会出现假阴/阳性结果，样品中的氧化酶、蛋白酶自身具有不稳定性，试剂保质期短，这也可能会对检测结果造成影响。刘蕊等［16］建立间接竞争ELISA 法快速检测酸枣仁、柏子仁等6 味中药材的AFs，并采用HPLC 法进行结果确证，两者的检测结果一致，可用于快速检测AFs。

2.4.2 胶体金免疫层析技术 胶体金免疫层析技术（GICT）是一种固相膜免疫分析方法，它将胶体金免疫技术与色谱层析技术相结合，具有灵敏度高、特异性强等特点，结果判断直观可靠，无需大型仪器设备和专业技术人员，适用于抽样现场快速筛查［17］。但GICT 制备抗体成本昂贵，样品提取效率较低，检测结果重复性差，易出现假阳性结果，需要进一步优化。李细芬等［18］采用GICT 检测酸枣仁等6 味中药材中AFB1含量，其结果与ELISA 法测定结果一致，所检测中药饮片中AFB1含量均符合要求。

2.4.3 荧光免疫分析法 荧光免疫分析（FIA）结合了高灵敏度的荧光技术和高特异性的免疫学反应。其原理是利用待测物在反应体系中特定结合位点的荧光强度，通过定性或定量分析获得检测结果。根据荧光标记材料的不同，可分为时间分辨荧光免疫分析法、荧光偏振免疫分析法和荧光激发共振能量转移免疫分析法等［19］。该技术易实现高通量、自动化检测，但抗体成本昂贵，仪器不便携，不适合现场筛查。余宇燕等［20］建立了一种快速灵敏的直接竞争FIA 用于检测陈皮、胖大海等5 味中药中AFB1含量。结果表明，AFB1-FITC 标记抗体的结合比率为4.19，可用于中药中AFB1的分析测定。

2.4.4 化学发光免疫法 化学发光免疫法（CLIA）采用化学发光试剂标记抗原或抗体，根据化学发光检测仪检测待测物的信号强弱来确定其含量。根据标记物的不同，可分为化学发光免疫分析法、化学发光酶免疫分析法和电化学发光免疫分析法。该技术无辐射、灵敏度高、线性范围宽、方法快速稳定、自动化程度高，标记物有效期长且稳定性好，但成本相对昂贵。吴震等［21］利用生物素亲和及抗原与抗体免疫反应，建立了一种基于光激化学发光均相免疫检测技术的AFB1检测方法。

2.4.5 免疫传感器 免疫传感器由生物识别元件和信号转换元件组成，结合了免疫检测技术和生物传感器技术。根据传导信号的不同，可分为光学免疫传感器、电化学免疫传感器和压电晶体免疫传感器等［22］。该技术是一种具有广泛发展前景的新型检测技术，其自动化程度高，不受样品颜色、浊度的影响，可同时检测多种真菌毒素［23］。Wu 等［24］采用以T7 核酸外切酶、脱氧核糖核酸为模板的银纳米簇，建立了用于检测AFB1的银纳米簇荧光生物传感器，该方法检测限可达0.89 pg/mL。

2.4.6 免疫芯片 免疫芯片是生命科学与微电子学等学科交叉发展而形成的新兴前沿技术。基本技术环节包括芯片微阵列制备、样品制备、生物分子反应和信号的检测与分析。根据其探针的不同，可分为基因芯片和蛋白芯片。该技术可进行多参数同步分析，但其还处于开发初期，点样器成本昂贵，且样品极易发生交叉反应，因此免疫芯片的应用范围受限，还需深入研究［25］。

2.5 表面增强拉曼散射技术

表面增强拉曼散射（SERS）法是一种新型的快速检测技术，其原理是样品吸附在贵金属粗糙表面时，拉曼光谱信号受表面等离子共振而增强。在对样品进行分析时，具有样品非接触、不破坏的特点［26］，同时可增强拉曼信号来实现检测极限的提高。该技术分辨率高、快速无损、设备携带方便，广泛应用于生物医药［27］、食品安全［28］等诸多领域。然而，具有较强SERS 效应的贵金属种类极少，很难制备出重现性好、灵敏度高的基底，并且贵金属增加了检测成本，难以商业化。基于免疫法的SERS 传感器可以在芯片上独立检测3 种真菌毒素［29］。在纳米溶胶由湿态向干态转化的过程中进行实时SERS采集的技术称为动态SERS（D-SERS），相较于常规SERS 信号，增加了2～3 个数量级。基于此，任菲等［30］采用D-SERS 对薏苡仁中的AFG1进行检测。该方法采用擦拭法提取样品表面的AFG1，以AuNP作为SERS 的增强基底进行D-SERS 分析，其检测限达到5.5 μg/kg。

3 黄曲霉毒素降解脱毒技术

目前，降解AFT 常用的脱毒技术有物理法、化学法和生物技术法。

3.1 物理法

物理降解脱毒技术是利用光、热、辐射等方式破坏AFT 的毒性，主要有高温加热法、吸附法、辐射法和溶剂萃取法等。

3.1.1 高温加热法 高温加热可破坏大部分毒素，但AFT 的降解温度高（280 ℃左右），并且高温加热同时也可能会破坏中药材基质结构，如蛋白质、氨基酸等。因此高温降解AFT 实际操作过程中存在较大困难，且能源消耗大，一般不宜采用。

3.1.2 吸附剂吸附法 吸附剂一般有活性炭、蒙脱石、沸石粉等。Martinez 等［31］研究表明活性炭能够有效吸附赭曲霉素和AFT，真菌浓度在所有实验对象中均下降。此法可吸附大部分毒素，成本低廉，但目前没有最高效的吸附剂，有待进一步研究。

3.1.3 辐射法 常用的辐射有γ 射线、紫外线、红外线、电子束等。其中，γ 射线照射和紫外线技术的降毒效果显著［32］。Nurtjahja 等［33］研究表明，肉豆蔻中黄曲霉菌种群总数及菌株活力随 γ 辐射剂量增加而下降。此外，Patras 等［34］研究发现，紫外线照射可显著降低纯水中的AFT（P＜0.05），并且增加紫外线剂量可降低细胞中AFT 引起的细胞毒性。但辐照耗能高，会对操作人员带来潜在身体伤害，因此实际应用中受阻。

3.1.4 溶剂萃取法 萃取溶剂有乙醇、乙腈-水、水溶性丙酮等溶液。陈建茹等［35］研究对比了75%乙醇与水对柏子仁中AFT 的脱毒效果，结果表明，75%乙醇更佳，但仍无法达到完全脱毒，且脱毒后的样品可能仍不符合法定限量标准。该法既无副产物产生，也不会破坏蛋白质结构，但要求精确的样品和溶剂的比例，萃取溶剂成本高且废液处理繁琐，因此在一定程度上限制了其应用。

3.2 化学法

化学法是指采用化学试剂处理与生物毒素发生化学反应，破坏其化学结构，从而降低或消除其毒性。传统化学试剂虽然能有效降解AFT，但同时可能存在化学残留会污染环境或影响药材化学成分。

3.2.1 碱处理法 罗小荣等［36］研究表明，1%碳酸氢铵溶液+2%～5%氨水清洗莲子，AFT 下降趋势明显，去除率可达90%以上。此法操作难度低，成本低廉，是一种适合于工业化大生产的清洗方法。

3.2.2 氧化处理法 氧化剂通过氧化分解AFB1末端的呋喃环，从而降低毒性，常用的氧化试剂有ClO2、H2O2、O3、Cl2等。Yu 等［37］研究发现，ClO2气体可以抑制黄曲霉菌菌丝生长、孢子萌发和产生AFB1。AFB1的降解率随着ClO2浓度的增加而提高，而且AFB1的降解速度明显加快。但该法同样面临化学残留问题而限制了其应用。

3.2.3 天然精油法 天然精油可有效抑制黄曲霉菌生长和其毒素合成［38］。李红玲，高微微［39］将挥发油直接混合于种子中、涂于表面、填充于包装中，发现一定剂量的何首乌挥发油具有抑菌效果。天然精油提取自中药，绿色无污染，且能够充分利用药材有效成分。这为药对养护提供了新思路，将易霉变中药与富含抗菌抑菌成分的药材按照合理的比例混合贮藏，在一定程度上可以避免药材霉变。但挥发油含量较低，成分复杂，使用难度大，成本昂贵。

3.3 生物法

生物脱毒法主要是利用微生物或其代谢产物进行脱毒，具有效率高、特异性强、绿色无污染的优势，且处理条件相对温和，不会破坏药材品质，因此成为最近研究热点之一。目前已经发现细菌、真菌及酵母菌等都具有降解AFT 能力［40］，该法包括生物酶解法、生物吸附法等［41］。

3.3.1 生物酶解法 生物酶解法是利用专一性和高效性的某些酶分解毒素分子的功能性基团，将AFT 降解为低毒或无毒化合物。目前，酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌等微生物已经被证实对黄曲霉菌具有显著的抑制效果［42］。黄曲霉毒素解毒酶和葡萄糖氧化酶等酶制剂也逐渐被用于AFT 的脱毒［41］。

3.3.2 生物吸附法 生物吸附法是利用微生物与AFT结合，形成菌体-AFT 复合体，达到脱毒目的。研究发现，酵母菌、乳酸菌和双歧杆菌可通过细胞壁吸附作用去除AFT，其吸附能力与细胞壁结构有关［43］。该法绿色环保，但吸附过程低效且可逆，并不能从本质上脱去毒性，因此高效可行的生物吸附剂有待进一步研究。

4 结语

中药中AFT 污染问题成为制约中药国际化的关键因素之一。国内在这一领域的研究从未停止过，但AFT 含量超标事件仍经常发生。因此，中药中AFT 检测及脱毒技术将成为当前及今后的一个研究热点。目前应用的AFT 检测技术中，仪器分析法具有灵敏度高、检测结果精确的优点，但仍有待解决的问题，如：样本前处理复杂、对仪器及专业技术人员要求高、难以满足即时检测等；免疫学检测方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷的特点，适用于现场快速检测。在未来研究中，开发出更灵敏、更快速、更经济的检测技术成为新的趋势和挑战。在AFT 降解脱毒技术研究领域，与传统的物理或化学降解方法相比，生物降解技术去除AFT 具有安全、高效、环保、无毒无害等优点，是未来研究AFT 防治的发展方向。因此，只有确保现有中药中AFT 检测和解毒技术与时俱进，才能保障用药安全有效，推动中药现代化、国际化进程。