如意金黄贴对良性前列腺增生大鼠TGFβ1、PTGS2 mRNA及相关蛋白的影响

池宁娟 刘明义 冯娟 石小鹏 王婧雯

(空军军医大学第一附属医院药剂科，陕西 西安 710032)

良性前列腺增生(BPH)是引起中老年男性排尿障碍最常见的一种良性疾病，其发病率随着年龄而增加〔1〕。BPH在中医上属于“癃闭”“淋证”的范畴，其主要的病机是湿热蕴结、气滞血瘀、脾肾气虚等〔2〕。如意金黄贴(RYT)是本研究依据《中国药典》2015版一部如意金黄散制成的外用贴剂，具有清热解毒，消肿止痛的功效，在临床上用于治疗BPH有较好的疗效，但其作用机制并不清楚〔3,4〕。本实验探讨RYT对BPH大鼠前列腺指数的影响及其可能的作用机制，以期为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD雄性大鼠，体重180～200 g，由空军军医大学实验动物中心提供，医动证字SCXK(军)2016-0007，动物使用许可证号：SYXK(军) 2016-0023。大鼠均在温度(25±2)℃、相对湿度45%～65%、光照12 h的清洁环境中饲养1 w后实验，饲养期间大鼠自由进食、饮水。

1.2实验药物和试剂 RYT RYT由医院药剂科制(批号：20161201)，每贴面积为18.84 cm2，重量2.9 g，每克相当于表面积6.50 cm2，含生药0.674 g/cm2；丙酸睾酮注射液，上海通用药业股份有限公司(批号：160702)，规格：25 mg/ml；保列治(Finasteride)：杭州默沙东制药有限公司(批号：R009405；规格：5 mg/片)。转化生长因子(TGF)β1和前列腺素内过氧化物合成酶(PTGS)2引物购于TakaRa公司。兔抗-Ⅰ型前胶原蛋白(Pro-COL-Ⅰ)、Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)、血管细胞黏附分子(VCAM)-1、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)、原癌基因c-Jun、c-Fos、山羊抗小鼠、兔IgG标记的辣根过氧化物酶(HRP)抗体均购自 Santa Cruz 公司。RAPI组织细胞裂解液购自上海碧云天公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、HRP化学发光底物购于Millipore公司。iQTM5多重实时荧光定量PCR仪，设备编号：582BR016236，购自美国Bio-Rad公司；多功能酶标仪，设备编号：N05C023603，购自德国贝克曼公司；电泳仪，设备编号：N10B014643，购自美国Bio-Rad公司。

1.3实验流程

1.3.1动物分组 取洁净级雄性SD大鼠40只，随机分为5组，即对照组、模型组、保列治组、RYT高剂量组、RYT低剂量组，每组8只。

1.3.2模型建立与给药方法 对照组注射生理盐水0.5 ml/kg，其余各组大鼠皮下注射丙酸睾酮10 mg/kg，每天1次，连续30 d。于造模第1天起给予药物干预，保列治组灌胃给药保列治(4.5 mg/kg)，RYT高、低剂量组背部脱毛区分别贴42.0 cm2/kg、21.0 cm2/kg的药物，对照组和模型组的大鼠背部脱毛区均贴基质贴，每天给药1次，连续30 d。

1.3.3标本采集 末次用药后大鼠禁食12 h，称体重，处死大鼠，取前列腺随即称重，计算前列腺指数(脏器重量/体重×1 000)。取前列腺组织腹叶2份，液氮冻存，一份RT-PCR测定前列腺组织中TGFβ1和PTGS2 mRNA表达，另一份Western印迹测定前列腺组织中有关蛋白的表达。

1.3.4RT-PCR分析前列腺组织中TGFβ1和PTGS2 mRNA表达 按照TaKaRa公司的说明书操作提取总RNA，紫外分光光度法测定RNA的含量及纯度，经测定A260/A280比值在1.8～2.0之间,进行cDNA模板合成。引物设计根据目的基因Genbank中的已知序列，由TakaRa设计并合成，GAPDH为内参。逆转录PCR严格按照试剂盒说明进行，iQTM5多重实时荧光定量PCR仪定量分析。RT-PCR引物合成序列：TGFβ1上游引物：5′-TCAGTGCCACATACCAACTGGAG-3′，下游：5′-GTGCCAACCGGTACCTTGCTA-3′(150 bp)；PTGS2上游引物：5′-GCGACTGTTCCAAACCAGCA-3′，下游：5′-TGGGT-CGAACTTGAGTTTGAAGTG-3′(112 bp)；GAPDH上游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，下游：5′-GGCACGTCAAGGCTGAGAATG-3′(143 bp)。

1.3.5Western印迹检测前列腺组织中Pro-COL-1、COL-1、VCAM-1、ERK、p-ERK、c-Jun和c-Fos蛋白表达 取冻存于液氮的前列腺组织，每组取样品2块置于冰浴玻璃研磨器中，加入1 ml组织裂解液，反复研磨使组织沉淀均匀地溶散在裂解液中，冰浴上裂解30 min，每隔10 min振摇1次。4℃ 12 000 r/min离心20 min，上清液即为组织蛋白提取液。BCA 法测定蛋白含量，总蛋白样品加入等体积变性液煮沸10 min。调整上样量为25 μg 蛋白/泳道，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝电泳(SDS-PAGE)，半干转膜、封闭，分别与抗Pro-COL-1(1∶500)、COL-1(1∶500)、VCAM-1(1∶500)、ERK(1∶500)、p-ERK(1∶1 000)、c-Jun(1∶400)、c-Fos(1∶500)一抗反应，4℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗(1∶3 000 ～ 1∶5 000)，37℃孵育 50～70 min，化学发光、显影、压片，以β肌动蛋白为内参，采用图像分析软件计算相对表达量。

1.4统计学分析 采用 SPSS17.0软件进行单因素方差分析、Games-Howell检验。

2 结 果

2.1RYT对BPH大鼠前列腺指数的影响 与对照组比较，模型组前列腺指数增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，保列治组、RYT高、低剂量组大鼠前列腺指数降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2RYT对BPH大鼠前列腺组织中TGFβ1、PTGS2 mRNA表达的影响 与对照组比较，模型组前列腺组织中TGFβ1、PTGS2 mRNA表达显著增高(P<0.05)。与模型组比较，保列治组和RYT高、低剂量组TGFβ1、PTGS2 mRNA表达显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组前列腺指数及前列腺组织中TGFβ1、 PTGS2 mRNA的表达

2.3RYT对BPH大鼠前列腺组织中Pro-COL-1、COL-1、VCAM-1蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组Pro-COL-1表达增加(P<0.05)，VCAM-1表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而COL-1表达增加不显著(P>0.05)。与模型组比较，RYT高剂量组COL-1下降、VCAM-1表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)；RYT低剂量组Pro-COL-1表达下降、VCAM-1表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.4RYT对BPH大鼠前列腺组织中ERK、p-ERK、c-Jun和c-Fos蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组p-ERK表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，c-Fos表达增加(P<0.05)。与模型组比较，保列治组和RYT高剂量组c-Fos表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，RYT低剂量组p-ERK表达增加(P<0.05)、c-Fos表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组前列腺组织中Pro-COL-1、COL-1、VCAM-1、ERK、p-ERK、c-Jun和c-Fos蛋白表达

3 讨 论

BPH俗称“前列腺肥大”，是一种缓慢进展性、以下尿路症状为主的疾病，是老年男性的常见病，随着年龄增加，患病率显著增高。目前BPH治疗方法主要是外科治疗和药物治疗，外科治疗效果较好，但大多数患者为中、老年人，基础疾病复杂，不适宜外科手术治疗或不愿意接受手术治疗；而药物治疗主要包括化学药物、中药及中药制剂治疗，化学药物有较多不良反应，因此，从中药或中药制剂中寻找安全、有效的治疗方法就显得尤为必要〔5～8〕。中医学认为湿热蕴结、气滞血瘀、肾阳亏虚、肾阴不足、脾肾气虚等因素为BPH的主要病机，因此清湿热、散淤结、利气机、化瘀血、扶元补虚为其治疗的原则〔2〕。如意金黄散是出自明代陈实功的《外科正宗》卷之一，收录在《中国药典》(2015 年版)的制剂，处方由姜黄、大黄、黄柏、苍术、厚朴、陈皮、甘草、生天南星、白芷和天花粉 10 味中药组成，具有清热燥湿、行气、散瘀、利水消肿的功效〔9〕。RYT是本单位依据如意金黄散制成的外用贴剂，在临床上用于治疗BPH，且疗效显著。RYT给药部位为会阴穴，该穴位主治疾病有小便不利、遗尿、遗精、勃起功能障碍等。本实验结果提示一定剂量的丙酸睾酮可致大鼠BPH，而RYT可有效抑制由丙酸睾酮所致大鼠BPH所引起的泌尿器官重量的指数。

目前研究认为生长因子、炎症反应、生殖激素水平紊乱、前列腺间质和上皮细胞相互作用等因素与BPH的发生密切相关〔10～12〕。TGFβ1是一种多肽类细胞生长因子，具有双向调节细胞凋亡、分化和增殖等多种生物活性，前列腺发育的微环境稳态主要是由促有丝分裂因子的刺激作用和 TGFβ1 的抑制作用的平衡来调节，在老年BPH患者血清中 TGFβ1 水平升高〔13〕。PTGS2为一种诱导性即刻反应基因，正常生理状况下，在大多数组织细胞不表达，但在炎症等病理反应过程中，受炎症介质、生长因子、细胞因子、促癌因子、缺氧、激素等刺激因素作用，其表达迅速上调，PTGS2主要产物前列腺素具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、抑制免疫监视、促进血管生成等生物活性〔14〕。本实验结果显示，BPH大鼠前列腺组织中TGFβ1和PTGS2 mRNA水平显著上升，而RYT可显著降低TGFβ1和PTGS2 mRNA水平。

前列腺间质与上皮细胞增殖和凋亡的平衡性破坏被认为是BPH发生和发展的生物学基础，而胶原蛋白(COL)是各组织中的重要成分并构成组织细胞外基质，COL-Ⅰ和Pro-COL-Ⅰ水平的异常会引起组织的增生〔15〕。本研究结果提示BPH大鼠前列腺组织中COL-Ⅰ和Pro-COL-Ⅰ增加，使用RYT可降低COL-Ⅰ和Pro-COL-Ⅰ表达水平。VCAM-1是免疫球蛋白超家族成员之一，能介导细胞黏附和信号转导〔16〕，ERK是将信号从表面受体传导至细胞核的关键，它的信号传递途径是涉及调节细胞生长、发育及分裂的信号网络的核心，p-ERK由胞质转位到核内，进而介导Elk-1、ATF、Ap-1、c-Jun和c-fos的转录活化，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的癌变等多种生物学反应〔17〕。本研究结果提示BPH大鼠前列腺组织中VCAM-1、ERK、p-ERK表达降低、c-Jun和c-fos表达增加，使用RYT可增加VCAM-1、ERK、p-ERK表达、降低c-Jun和c-fos表达。

该药前期研究〔4〕表明其可降低BPH大鼠前列腺上皮细胞增生及平滑肌增厚，减轻间质纤维细胞增生，对MAPK信号通路的分子有调节作用。本研究RYT可能通过降低TGFβ1、Ptgs-2 mRNA和Pro-COL-1及c-Fos表达，增加VCAM-1和p-ERK表达而抑制大鼠BPH。本研究通过探讨RYT在BPH中的作用及其机制，为BPH的防治提供了新的思路和方法，也为RYT的临床应用提供了分子机制依据。