续骨丹对兔胫骨骨折bFGF及TGF-β/BMPs信号通路表达的影响

刘海军 董万涛 王前源 黄国源 汪庚申 牛存良 张东亮

(1武威市人民医院骨二科，甘肃 武威 733000；2甘肃中医药大学附属医院骨科)

研究显示中药在促进骨折愈合方面能够起到一定的作用〔1,2〕，中药无论是外敷或是内服均能有效促进骨折的愈合，其中外敷能够将药物直接作用于骨质损伤区域，促使药物能够快速分散到损伤组织中，同时能够使得骨折部位肌肉组织收缩，促进骨折愈合。虽研究发现中药能够促进骨折愈合，但是对于骨折愈合的机制研究报道较少。本研究所使用的续骨丹属于中药外敷方剂，更是非物质文化遗产，已有研究表明其能够通过调节血管内皮生长因子(VEGF)对骨折愈合产生影响，但对于骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF)-β、碱性成纤维细胞因子(bFGF)表达研究较少〔3,4〕，本研究旨在探讨续骨丹兔胫骨骨折bFGF及TGF-β/BMPs信号通路表达的影响。

1 材料与方法

1.1动物模型制作 选取成年新西兰家兔48只，由动物实验中心提供，雌雄不限制，体重约3 kg。对74只家兔按随机抽样的方式将其分为对照组和观察组，每组24只。采用3%戊巴比妥钠对家兔耳缘静脉注射麻醉，剂量为30 mg/kg。麻醉成功后将家兔俯卧位固定于手术床上，模型制作均选取左后腿，去掉毛后正常消毒铺单，于左后腿内侧做一约3 cm手术切口，剥离肌肉充分暴露左侧胫骨中段，使用钢锯将胫骨沿中段锯断，不做其他任何固定，而后冲洗手术视野，确保无渗血后逐层缝合切口，模式制作完成。术后给予所有大白兔连续3 d肌注青霉素40万U/d。从术后第1天开始，观察组给予续骨丹外敷，剂量为150 mg/kg，再用白醋将续骨丹调至糊状，使用新鲜葱汤擦洗骨折处后将续骨丹敷于该处，并使用油纸包裹固定，敷药隔1 d 1次，1次敷药约3 h；对照组正常喂养不给予其他任何处理。

1.2试剂及仪器 选用北京博奥公司提供的兔BMP、TGF-β、bFGF试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色剂；选用重庆鼎国公司提供的兔BMP、TGF-β、bFGF酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，其余所有仪器如枪头、恒温箱等由神经病理学实验室提供。

1.3方法 两组兔子在手术后第1、3、5、7周(每次6只兔子)行X线片检查骨折处骨痂生长情况及骨折愈合时间。于每个时间点使用ELISA测定两组血清中BMP、TGF-β、bFGF含量，而后处死兔子后取骨折处标本利用免疫组化法对各时间点的标本进行BMP、TGF-β、bFGF局部组织表达检测，分析其平均光密度值。

1.4统计学方法 采用SPSS26.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1X线片结果 两组X线片检查结果显示：术后1、3 w，两组骨折处无明显差异，骨折线均清晰可见；术后5 w，观察组骨折线模糊，外骨痂已形成并将断端完全连接，对照组可见有少量骨痂逐渐形成；术后7 w，观察组骨折已基本愈合，对照组骨折处骨折线模糊，骨髓腔已部分连通，见图1。

图1 两组骨折愈合情况X线片

2.2两组不同时间点血清BMP、TGF-β、bFGF含量比较 观察组所有时间点BMP均高于对照组，术后1 w及术后5 w时差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。观察组所有时间点TGF-β均高于对照组，术后3 w差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。观察组所有时间点bFGF均高于对照组，术后3 w及术后5 w时差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3两组不同时间点BMP、TGF-β、bFGF免疫组化表达比较 术后3 w两组BMP、TGF-β光度值差异有统计学意义(P<0.05)。术后5 w两组bFGF光度值组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、3，图2。

表1 两组不同时间点血清BMP、TGF-β含量比较

表2 两组不同时间点血清bFGF含量及BMP光度值比较

表3 两组不同时间点TGF-β、bFGF光度值比较

3 讨 论

骨折是临床中最为常见的疾病之一，骨折快速愈合的关键在于骨折断端的重建和修复，该过程主要依赖于成骨细胞的诱导，在诱导过程中，血管的进一步重建是其前提条件，血管的重建将直接影响到骨折的愈合速度，若骨折断端血液供应较差，甚至会出现骨不连情况〔5〕。研究〔6，7〕表明，中药能够改善骨折断端处的血液循环，促进成骨细胞的诱导及血管的修复等。中医认为影响骨折愈合最重要的影响因素为瘀血，在中医理论中骨折的整个愈合过程主要分为三步，“淤去”“新生”“骨合”，故活血化瘀是治疗骨折的关键前提。国内外已有学者对于续骨丹进行研究〔8～10〕，结果表明，续骨丹能够提高骨痂中VEGF表达，从而达到加快骨折断端血管重生的目的，最终使得骨折愈合的速度加快。随着研究的不断深入〔11，12〕。

BMP是骨折愈合过程中骨生成的启动因子，能够起到诱导成骨细胞、参与骨生长和修复等重要作用，BMP的主要作用机制在于诱导间充质细胞表面的BMP受体，在外界其他因素的影响下，使间充质细胞转化为成骨细胞，从而促进骨折断端的骨细胞生长。同时BMP还能够在一定程度上抑制破骨细胞的生理功能，使得骨折的愈合加快〔13，14〕。TGF-β的主要作用在于抑制破骨细胞的进一步激活和活化，抑制骨髓腔中间充质细胞向脂肪细胞的转化，同时TGF-β还能够促进成骨细胞的活性增加，Ⅰ型胶原和骨桥蛋白合成增加，能够使骨质积累，促进骨折愈合。bFGF是人体内毛细血管增殖的重要刺激因子，能够促进骨折断端处的毛细血管增生，使得骨折断端处血液供应不断增加〔14〕。

本研究结果提示，TGF-β与bFGF、BMP存在拮抗作用，而bFGF与BMP则存在一定的协同作用。由此可见，骨折在发生后局部的生理平衡将会被打破，受到刺激的骨折局部将会出现一系列的应激反应，引发3种细胞因子的增加，再通过相关一系列的信号转导，启动骨折的修复过程，加速骨折的愈合〔15，16〕。本研究表明续骨丹能够增加BMP、TGF-β及bFGF的表达，提示其在促进骨折愈合的机制与BMP、TGF-β、bFGF的基因转录及翻译表达有密切相关性。