鸡骨草不同提取部位体外抗肿瘤活性筛选

李庭树 莫仁高 雷智冬 黄锁义

(右江民族医学院 1基础医学院，广西 百色 533000；2临床医学院；3广西中医药大学药学院；右江民族医学院 4药学院；5科学实验中心)

鸡骨草又名黄头草、黄仔强、大黄草、猪腰草，为豆科Leguminosae，该植物主要分布于广东、广西等地。鸡骨草全草除其种子外均可入药，具有利湿退黄，清热解毒，疏肝止痛等功效〔1，2〕，鸡骨草是一种药食两用植物，在春夏潮湿季节用来煲汤及制作凉茶等〔3〕。鸡骨草药理作用是多方面的，它涉及降脂保肝〔4，5〕、抗菌、抗炎镇痛、增强免疫、抗氧化〔6～8〕、促进伤口愈合、治疗母儿ABO血型〔9〕不合等多种生物活性。在前期试验研究中，发现鸡骨草醇提取物对小鼠肝癌 H22荷瘤小鼠有一定的抗肿瘤作用〔10〕。本文旨在探讨鸡骨草体外抗肿瘤活性及确定其活性部位。

1 资料与方法

1.1材料与仪器 鸡骨草购自广西百色市(经右江民族医学院民族医学教研室覃道光副教授鉴定为豆科相思子属植物广东相思子的全草)；细胞株人胃癌细胞株SGC-7901、人肝癌细胞株BEL-7404和人乳腺癌细胞株 MCF-7 细胞株购于中国科学院昆明细胞库)；RPMI1640 培养基、DMEM高糖培养基(赛默飞世尔科技公司)；优级胎牛血清(AusGeneX)；无菌磷酸盐缓冲液(PBS)、CCK-8试剂(博士德)；二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)；0.25% EDTA-胰酶(北京索来宝公司);Hoeshst33258染色液(凯基生物)；碘化丙啶(PI)染色试剂盒〔生工生物(上海) 有限公司〕；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等其他试剂均为分析纯。

RE-3000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；循环水式多用真空泵(SHB-B88 型，郑州长城科工贸有限公司)；真空干燥箱(DZF-6020 型，广州市星烁仪器有限公司)；CO2培养箱(上海力康HF90)；多功能酶标仪(德国伯托 Tri Star LB941)；电子天平(FA1204B 型，上海天美天平仪器有限公司)；ALPHA1-2/LD-Puls冷冻干燥机(德国CHRIST)；倒置荧光显微镜为尼康公司产品；流式细胞仪(BD公司)。

1.2鸡骨草提取物的制备 取鸡骨草全草干燥粉末用95%乙醇进行加热回流提取，过滤，浓缩至膏状即得鸡骨草的乙醇粗提取物。将乙醇粗提取物溶于水中形成混悬液，分别用石油醚、乙酸乙酯与正丁醇依次萃取，回收萃取溶剂继而得到石油醚部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏、正丁醇部位浸膏和水层部位浸膏。最后将浸膏粉制成冻干粉，准确称取鸡骨草4个不同部位，用1% DMSO溶液溶解，配成相应浓度的母液的浸膏，0.22 μm过滤，分装存储。4℃冰箱保存，使用时以完全培养基稀释至所需浓度。

1.3鸡骨草提取物体外抗肿瘤作用

1.3.1细胞培养 BEL-7404细胞、SGC-7901细胞在RPMI1640培养基，MCF-7细胞在 DMEM 培养基(含10% 胎牛血清，青霉素，链霉素各 100 U/ml) 中，于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中常规培养。显微镜下观察细胞生长状态，每天更换一次培养基，每2 d传代一次。

1.3.2CCK-8检测 取对数生长的BEL-7404细胞、SGC-7901细胞、MCF-7细胞以5 000个/每孔的密度接种于 96 孔板内于培养箱中继续培养。将鸡骨草4 种萃取部位经 0.22 μm 滤膜过滤后，用DMSO梯度稀释，每孔细胞加入10 μl使其在每孔的终浓度为 10、20、40、60、80 mg/ml，每个浓度组各设 5 个复孔，于加药培养 24 h 后每孔加入10 μl CCK-8 溶液，继续培养 1 h，取出于 450 nm检测吸光度。

1.3.3形态学观察 将BEL-7404细胞、SGC-7901细胞、MCF-7细胞以 1 万个/每孔的细胞密度接种于 6孔板中，24 h后加入200 μl浓度为60 mg/ml的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取部位处理24 h 后在倒置显微镜下观察细胞形态变化。

1.3.4Hoechst33258染色检测BEL-7404细胞凋亡 取处于对数生长期的BEL-7404细胞，接种于 6 孔培养板，每孔加入20×105个细胞。设对照组和不同浓度的给药组，细胞贴壁后，加入浓度为20、40、60 mg/ml的乙酸乙酯萃取物。药物作用24 h 后吸出培养基，用PBS清洗2次，每孔加入1 ml的4%甲醛固定液，于4℃冰箱中固定30 min，取出PBS洗3次，加500 ml Hoechst33258染液，在37℃培养箱中避光孵育30 min。用PBS 清洗3次，在激发波长 350 nm，发射波长 460 nm的荧光显微镜下随机拍照。

1.3.5流式细胞仪检测鸡骨草乙酸乙酯萃取部位对BEL-7404细胞周期的影响 取对数生长期细胞以1×105个/每孔的密度接种于 6 孔板中，细胞贴壁后，加入200 μl不同浓度乙酸乙酯萃取物(20.0、40.0、60.0 mg/ml)继续培养24 h 后，收集细胞用70%预冷乙醇固定，4℃避光过夜，用预冷 PBS洗两遍，加入碘化丙啶(PI)避光染色30 min，上流式细胞仪检测，分析各组样本 DNA 含量及周期变化。

1.3.6膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/PI检测鸡骨草乙酸乙酯提取物对BEL-7404肿瘤细胞凋亡率的影响 取对数生长期细胞以 1×106个/每孔的密度接种于 6 孔板中，细胞贴壁后，加入200 μl不同浓度乙酸乙酯萃取物(20.0，40.0，60.0 mg/ml)继续培养24 h 后，用0.25%胰酶消化离心，加入1×结合缓冲液配置成浓度为1×106个/ml的细胞悬液，吸取100 μl细胞悬液于EP管中，分别加入5 μl FITC和PI常温避光混匀孵育15 min，加400 μl 1×结合缓冲液，并于1 h内上机检测。

1.4数据处理 采用GraphPad Prism软件进行方差分析。

2 结 果

2.1鸡骨草提取物对四种细胞增殖的影响 与对照组(浓度为0 mg/ml)相比，作用 24 h 后，石油醚部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位对BEL-7404细胞、SGC-7901胃癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞均有明显的抑制作用且呈浓度依赖关系。从表1可以看出，乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位抗肿瘤活性较强。经拟合计算，石油醚萃取部位作用BEL-7404细胞、SGC-7901胃癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞后的 IC50值为7 788.0、390.0、610.5 mg/ml，乙酸乙酯萃取部位的 IC50值为40.72、46.74、39.87 mg/ml。正丁醇萃取部位的 IC50值为66.06、68.41、46.36 mg/ml。水萃取部位的 IC50值为63.91、74.99、80.96 mg/ml。

2.2鸡骨草提取物对肿瘤细胞形态的影响 在倒置显微镜下观察各组细胞形态，可见阴性对照组的BEL-7404、SGC-7901、MCF-7 细胞贴壁生长，大小均匀，胞质透亮，折光性好，增殖旺盛。3种肿瘤细胞经浓度为60 mg/ml的乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位给药处理 24 h后，均显著改变了细胞形态，表现为细胞密度明显减小，细胞收缩变圆，细胞间距变大，贴壁作用减弱。石油醚部位和阴性对照组对3种细胞株密度影响不明显，形态上石油部位和阴性对照组3种细胞形态几乎没有变化。见图1。

表1 不同浓度鸡骨草各部位提取液对SCG-7901、BEL-7404、MCF-7细胞增殖的影响(抑制率，

图1 鸡骨草不同提取部位对 3种肿瘤细胞株形态的影响(×200)

2.3鸡骨草不同提取部位对肿瘤细胞凋亡的促进作用 阴性对照组细胞饱满，胞质丰富，胞核圆形或椭圆形，染色质荧光着色均匀。加药组明显看到细胞数量减少，细胞核体积变小、皱缩，可见致密浓染荧光，染色体 DNA呈浓染的团块状、颗粒状分布，提示出现了明显的凋亡特征，且凋亡细胞数目随着药物浓度的增加而增加，见图2。

2.4鸡骨草不同浓度乙酸乙酯萃取部位对BEL-7404细胞周期分布的影响 与阴性对照组比较，不同浓度鸡骨草乙酸乙酯萃取部位可明显增加肝癌BEL-7404细胞G0/G1期比例，明显降低S期及G2/M期比例，能诱导肝癌BEL-7404细胞发生凋亡并呈剂量依赖关系(P<0.01)，见表2。

2.5鸡骨草乙酸乙酯萃取部位对BEL-7404细胞凋亡率的影响 以细胞早期凋亡与晚期凋亡和计算细胞平均凋亡率，各浓度鸡骨草乙酸乙酯萃取物作用于 BEL-7404细胞24 h后，与阴性对照组(1.76%)相比细胞凋亡率随着药物浓度(20、40、60 mg/ml)的加大而增大(14.66%，39.30%、59.40%，P<0.05，P<0.01)。见图3。

图2 Hoechst33258荧光染色法观察鸡骨草乙酸乙酯部位对BEL-7404细胞凋亡形态学的影响(×200)

表2 鸡骨草乙酸乙酯萃取部位对BEL-7404肝癌细胞周期的影响

图3 鸡骨草乙酸乙酯萃取部位对BEL-7404细胞凋亡率的影响

3 讨 论

植物药具有较为显著的疗效和较小的不良反应等特点,在用于癌症治疗的药物中，植物药占比越来越大。我国有丰富的药用植物种质资源，筛选和分离中药抗癌活性成分，阐明其抗癌作用和机制，对抗癌药物的研究和开发及癌症治疗具有重要的意义。

本实验研究结果显示：鸡骨草乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位对 BEL-7404 细胞、 SGC-7901 胃癌细胞、MCF-7 乳腺癌细胞均有明显的抑制作用且呈浓度依赖关系，以乙酸乙酯萃取部位抗肿瘤活性最强。Hoechst33258 荧光染色法及流式细胞术实验结果表明：鸡骨草乙酸乙酯萃取部位可诱导肿瘤细胞发生凋亡，细胞凋亡率随着药物浓度成正比。在后续的研究中以鸡骨草乙酸乙酯萃取部位为研究对象，对其进一步提取分离。本实验为鸡骨草用于临床治疗癌症提供了实验依据和理论基础,为后期分离鸡骨草具有抗肿瘤作用的单体化合物指明方向，但鸡骨草抗肿瘤的药效物质基础和分子作用机制还有待进一步通过体内实验研究。