自发性高血压大鼠心肌细胞舒缩功能、钙瞬变及钙敏感性

于丁 柳金金 刘园 李吉和 李军霞 王永利

(河北医科大学 1第一医院重症医学三科，河北 石家庄 050000；2药理学教研室)

高血压可引起心室肥厚、心力衰竭及冠心病等，这些疾病发病率随患者血压的增加而增加，提示随着高血压病程的发展，心功能改变是一个渐进过程〔1〕。高血压患者在早期就可出现心脏舒张和收缩功能的异常，一般认为，Ca2+是调控心肌细胞收缩和舒张的关键因素，高血压时心肌细胞内钙代谢及信号转导系统会发生异常〔2〕。细胞内钙代谢及其介导的信号转导系统的异常可导致心肌舒张和收缩功能的改变，且与心肌肥厚及心室重构的发生关系密切〔3〕。因此，了解高血压发生发展过程中钙瞬变和钙敏感变化具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1主要试剂和设备 胶原酶Ⅱ和L-Glutamic Acid为Invitrogen 公司产品，fura2-AM，HEPES、taurine和戊巴比妥钠为Sigma公司产品。清醒动物鼠尾血压测定仪购自Letica公司，可视化动缘探测系统购自美国Ion Optix Co.公司。

1.2实验动物 自发性高血压大鼠(SHR)，雄性，体重180～230 g〔购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2006-0009〕。对照组Wistar大鼠，雄性，体重180～230 g〔购自河北医科大学动物中心，许可证号SYXK(冀)2008-0026〕。

1.3大鼠血压测定 采用鼠尾法测定血压。将待测大鼠于40℃预热10 min后，置于清醒动物鼠尾血压测定仪的测定套筒内，测量清醒和安静状态下的尾动脉收缩压(SBP)，连续测定3次，取其平均值。

1.4单个心室肌细胞的急性分离 大鼠腹腔注射肝素2 500 U，0.5 h后，腹腔注射戊巴比妥钠45 mg/kg，迅速打开胸腔，取大鼠心脏置于预冷的无钙台氏液中，然后将其固定于Langedorff灌流系统，经主动脉逆行灌流含30 mmol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)无钙台氏液5 min(8 ml/min)；随后用含有12 mg胶原酶Ⅱ无钙台氏液30 ml反复循环灌流20 min，至心脏松软，再用无钙台氏液冲洗心脏5 min，以冲洗上述含酶液体。剪取左心室，于10 ml KB中剪碎，震荡10 min，用尼龙网过滤细胞，再在室温下静置1 h后，分三级复钙使其终浓度达1.8 mmol/L，然后将细胞保存于正常钙台氏液中。上述实验过程中持续给予灌流液充100%氧气，并保持灌流液温度在(36±1)℃。KB液和台氏液均由实验室配制。

1.5同步检测单细胞舒缩功能和钙瞬变 将分离好的心肌细胞负载钙敏感性荧光染料fura2-AM，25℃避光孵育30 min后，置于细胞槽，以正常台氏液持续灌流(25℃，1 ml/min) 5 min后，应用可视化动缘探测系统动态跟踪，并同步检测单细胞的舒缩活动和钙瞬变。即以光电刺激器通过安置在细胞槽底部的一对平行铂丝电极对心肌细胞进行场刺激，刺激频率均为0.5 Hz，脉宽4 ms。通过倒置显微镜选取合适的心室肌细胞。并用该系统照相机以8.3 ms/帧的速率记录单细胞收缩变化图像，同时用双激发荧光光电倍增系统检测心肌细胞荧光信号的变化情况。计算两种波长荧光强度的比值(F340/F380)，该比值可反映心肌细胞内游离Ca2+浓度的改变情况(钙瞬变)〔4〕。观察指标：单个心肌细胞收缩幅度(Peak h)、收缩速度(Dep v)、舒张速度(Ret v)、舒张期钙(DCa)、收缩期钙(SCa)、钙瞬变幅值(ΔCa)、舒张期钙减少50%所需时间(T50DCa)、钙达峰时间(TTPCa)。

1.6心肌细胞对钙敏感性的检测 用不同浓度外钙(2.4、3.6、5.4 mmol/L)灌流两组心肌细胞，然后以细胞内fura2荧光强度比值变化为横坐标，以不同浓度外钙作用时细胞收缩幅度的变化为纵坐标，绘制收缩幅度与荧光强度比值的关系曲线，观察细胞外钙对心肌细胞收缩力和钙瞬变的影响〔5〕。

1.7统计学方法 采用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1SHR血压的经时性变化 6、12和18月龄对照组SBP分别为(101.6±15.7)、(111.2±17.4)和(118.9±20.4)mmHg，不同月龄间无统计学差异(P>0.05)。SHR组6、12和18月龄SBP分别为(185.5±10.1)、(195.3±10.3)组和(225.2±12.3)mmHg，显著高于同龄对照组(P<0.01)。

2.2SHR心肌细胞舒缩功能变化 各月龄对照组心肌细胞的Dep v、Peak h和Ret v无明显变化(P>0.05)。SHR组6月龄Peak h和Dep v均显著高于其同龄对照组(P<0.05)，12月龄和18月龄时Peak h和Dep v与6月龄时相比均明显降低(P<0.05)，且均显著低于同龄对照组(P<0.05)；SHR组6、12和18月龄Ret v值均显著低于同龄对照组(P<0.05或0.01)，且随着月龄延长，Rep v值进一步降低(P<0.05)，见表1。

2.3SHR心肌细胞钙瞬变 各月龄对照组心肌细胞DCa、SCa、ΔCa2+、TTPCa、T50DCa均无明显差异(P>0.05)。12月龄和18月龄SHR组心肌细胞DCa与同龄对照组相比明显降低(P<0.05或0.01)，SCa无明显变化。与同龄对照组相比，6、12和18月龄SHR心肌细胞ΔCa2+明显升高(P<0.01)；18月龄TTPCa明显高于同龄对照组(P<0.01)；6、12和18月龄SHR心肌细胞T50DCa均比同龄对照组明显增加(P<0.01)。见表1。

表1 两组不同月龄心肌细胞Peak h、Ret v和Dep v、心肌细胞钙瞬变比较

2.4SHR心肌细胞钙的敏感性 各个月龄对照组心肌细胞的钙敏感性无明显变化(P>0.05)。SHR组6、12和18月龄时心肌细胞钙敏感性与同龄对照组明显降低(P<0.05或0.01)；而且，随着月龄的延长，钙敏感性逐渐降低(P<0.05)，见表2。

表2 两组不同月龄心肌细胞钙敏感性比较

3 讨 论

高血压已经成为人类致残或死亡的主要危险因素之一〔6〕。目前用于高血压动物模型有很多，主要有SHR模型、肾血管性高血压模型、遗传性高血压模型、应激性高血压模型、神经源性高血压模型、高盐高血压动物模型等〔6〕。高血压发展过程中心肌细胞内Ca2+的浓度会发生变化，有研究报道高血压大鼠心肌细胞内Ca2+浓度会升高，但也有研究表明心肌细胞内Ca2+浓度没有明显变化〔7〕。心脏收缩和舒张功能异常在高血压早期就可出现。但对血压升高后心肌舒缩功能异常的研究结果不尽相同。有报道心肌收缩功能加强，舒张功能下降，也有报道心肌收缩和舒张功能均出现下降〔8，9〕，这些不同的报道可能是由于不同时期有不同的变化。因此，研究不同时期高血压心肌细胞收缩力及钙瞬变的变化对于认识高血压性心脏病的发病机制和临床治疗具有指导意义。本研究结果提示在高血压形成早期，SHR心肌细胞收缩功能增强，随后随着高血压的进程，心肌细胞收缩功能减弱，而SHR心肌细胞舒张功能则从6月龄时即开始下降。

Ca2+介导的兴奋-收缩耦联是心肌细胞收缩过程中的关键环节〔10〕。本研究提示SHR在6月龄时仍处于高血压的代偿期，且高血压发生发展过程中，心肌细胞内钙的改变以舒张期钙的改变为主。而且，随高血压大鼠月龄的增加，SHR心肌细胞内ΔCa2+逐渐增加，这可能是SHR早期心肌收缩力升高的主要原因之一。影响心肌细胞收缩力的主要因素有两方面，一是心肌细胞内钙瞬变，二是心肌细胞对钙敏感性的改变〔11〕。在一些心血管疾病如心肌肥大，心力衰竭和心律失常等发生时，钙稳态遭到破坏，钙瞬变和钙敏感性也会发生变化，阐明这些变化与疾病的关系，有助于了解病变心肌的发生机制，也为临床药物治疗提供参考〔12，13〕。尽管SHR心肌细胞的ΔCa2+随月龄增加而不断增加，但心肌细胞的收缩力在12和18月龄时反而减小，高血压引起的心肌细胞钙敏感性的下降，可能是中晚期心肌细胞收缩力降低的原因之一。肌丝内部的格栅结构的变化可减弱肌动蛋白-肌球蛋白的交互作用，引起心肌细胞内肌丝对钙的敏感性下降。肌钙蛋白对钙结合能力的降低也可能导致心肌细胞敏感性下降〔14，15〕。因此，高血压后心肌细胞敏感性下降可能是由于心肌细胞肌丝伸展及格栅结构发生某种改变，或者是由于肌钙蛋白对钙结合能力降低而引起，具体机制有待进一步研究。