过表达PTEN抑制呼吸道合胞病毒感染支气管上皮细胞炎症反应的机制

种肖宇 焦可然 吴妍 张红 张长庚

(衡水市人民医院检验科，河北 衡水 053000)

支气管哮踹是临床常见的慢性气道炎症疾病，可以参与多种细胞的发生与发展，如心肌细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等〔1，2〕，呼吸道合胞病毒(RSV)感染细胞后容易引发肺炎、支气管炎、哮喘等呼吸系统疾病，严重者可导致死亡〔3,4〕。支气管上皮细胞损伤或功能受损可直接导致哮喘的主要病理特征〔5〕，RSV感染支气管上皮细胞后破坏其细胞结构，造成细胞凋亡产生大量炎症因子〔6〕。第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)具有蛋白质和磷酸酶活性，可以负向调控磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路维持细胞的生理功能〔7〕，在多种组织和细胞中异常表达，在细胞凋亡、氧化应激和炎症反应等过程中具有重要作用〔8,9〕。胡彩莉等〔10〕研究结果显示，PTEN在哮喘中表达下调，过表达PTEN可以抑制气道平滑肌细胞增殖。但是关于PTEN和RSV感染支气管上皮细胞的研究机制相对较少，因此本研究通过RSV感染支气管上皮细胞16HBE，探讨过表达PTEN在RSV感染支气管上皮细胞凋亡、氧化应激和炎症反应的作用，旨在为哮喘发病机制提供合理的技术研究基础。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂 人支气管上皮细胞16HBE购自中国科学院上海细胞库；RSV-Long病毒2型株购自中国预防医学科学院病毒研究所；胎牛血清、RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000转染试剂盒、TRIzol试剂盒购自美国Invitrogen公司；Prime Script RT逆转录试剂盒、SYBR Green Master Mix试剂盒购自大连Takara公司；PTEN抗体、增殖细胞核抗原(PCNA)抗体、B细胞淋巴瘤基因(Bcl)-2抗体和Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体购自美国Abcam公司；MTT、BCA试剂盒、肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒、白细胞介素(IL)-1β试剂盒和IL-6试剂盒购自上海碧云天公司；凋亡试剂盒购自江苏凯基生物公司；丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒购自南京建成生物研究所；转染空载体(Vector)、PTEN和引物由上海吉玛公司设计合成。

1.2细胞培养与分组 将支气管上皮细胞16HBE在含有胎牛血清的RPMI1640培养基温度37℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中孵育培养，每2 d换一次培养液,在培养液内加入0.25%胰酶消化传代培养。选取生长状态良好的细胞，将细胞分为4组：(1)RSV组：在支气管上皮细胞16HBE感染0.000 1 PFU/ml的RSV病毒，2 h后清洗病毒溶液，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍，然后置于在含有胎牛血清的RPMI1640培养基内继续培养24 h；(2)Control组：支气管上皮细胞16HBE不做任何处理，常规条件下正常培养；(3)RSV+vector组：在支气管上皮细胞16HBE转染空载体(记为vector)后，用RSV感染细胞；(4)RSV+PTEN组：支气管上皮细胞16HBE转染过表达PTEN(记为PTEN)后，用RSV感染细胞。其中，细胞转染严格按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明的操作步骤进行。

1.3qRT-PCR检测PTEN mRNA表达 取对数生长期支气管上皮细胞16HBE，PBS清洗细胞，采用TRIzol试剂分离提取各组细胞总RNA，检测浓度和纯度后，经Prime Script RT逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，以cDNA为模板按照SYBR Green Master Mix试剂盒说明进行PCR扩增，以GAPDH为模板，通过2-ΔΔCt法计算PTEN mRNA表达。

1.4Western印迹检测PTEN、PCNA、Bcl-2和Bax蛋白表达 取对数生长期支气管上皮细胞16HBE，在冰上加入蛋白裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，通过BCA试剂检测定量。蛋白变性后，经凝胶电泳上样处理后，转移到转聚偏二氟乙烯膜上，脱脂牛奶封闭培养，再加入一抗PTEN、PCNA、Bcl-2和Bax，4℃孵育过夜培养，然后再加入二抗，室温下孵育培养2 h，加入化学发光试剂显影、曝光，经Quantity One软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，计算蛋白表达。

1.5MTT检测细胞活力 取对数生长期支气管上皮细胞16HBE调整细胞密度，接种在96孔板内，培养48 h后，在每孔内加入5 mg/ml的MTT溶液，继续培养4 h去掉培养基，加入150 μl的二甲基亚砜溶液，室温震荡混匀后，在酶标仪490 nm处检测吸光度值，计算细胞活力。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期支气管上皮细胞16HBE，在培养液内调整细胞密度，采用结合缓冲液与沉淀的细胞悬浮，按照凋亡试剂盒要求加入5 μl膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)、碘化丙啶(PI)溶液，室温反应15～20 min，注意避光反应，然后置于流式细胞仪上检测细胞凋亡率。

1.7酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平 取对数生长期支气管上皮细胞16HBE，离心后取细胞上清液，严格按照MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-1β和IL-6试剂盒说明书，检测MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。

1.8统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1过表达PTEN对RSV感染后支气管上皮细胞中PTEN表达的影响 与Control组相比，RSV组PTEN mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05)，与RSV+vector组相比，RSV+PTEN组PTEN mRNA和蛋白表达明显增加(P<0.05)，见图1和表1。

2.2过表达PTEN对RSV感染后支气管上皮细胞活力的影响 与Control组相比，RSV组的细胞活力、PCNA蛋白表达均明显降低(P<0.05)；与RSV+vector组相比，RSV+PTEN组的细胞活力、PCNA蛋白表达均明显增加(P<0.05)，见表1和图2。

2.3过表达PTEN对RSV感染后支气管上皮细胞凋亡的影响 与Control组相比，RSV组的细胞凋亡率、Bax蛋白表达均明显增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)；与RSV+vector组相比，RSV+PTEN组的胞凋亡率、Bax蛋白表达均明显降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05)，见表1和图3、4。

2.4过表达PTEN对RSV感染后支气管上皮细胞氧化应激的影响 与Control组相比，RSV组MDA含量明显增加(P<0.05)，SOD活性和GSH-Px表达明显降低(P<0.05)；与RSV+vector组相比，RSV+PTEN组MDA含量明显降低(P<0.05)，SOD活性和GSH-Px表达明显增加(P<0.05)，见表2。

2.5过表达PTEN对RSV感染后支气管上皮细胞炎症反应影响 与Control组相比，RSV组TNF-α、IL-1β、IL-6均明显增加(P<0.05)；与RSV+vector组相比，RSV+PTEN组TNF-α、IL-1β、IL-6均明显降低(P<0.05)，见表2。

表1 过表达PTEN对RSV感染后支气管上皮细胞活力、凋亡及细胞中PTEN表达的影响

图2 过表达PTEN对RSV感染后 支气管上皮细胞PCNA蛋白表达的影响

1～4:Control组,RSV组,RSV+vector组,RSV+PTEN组图3 Western印迹检测Bcl-2、Bax蛋白表达

图4 过表达PTEN对RSV感染后支气管上皮细胞凋亡的影响

表2 过表达PTEN对RSV感染后支气管上皮细胞氧化应激及细胞炎症反应的影响

3 讨 论

支气管哮踹具有反复发作、病程长、发病率高等特点，其发病机制较为复杂，与遗传、环境、吸烟、呼吸道感染、鼻炎等相关〔11〕。支气管上皮细胞作为呼吸道第一道防线，在维持呼吸道稳态中具有重要的作用，但易受到外界因素感染和炎症反应的影响，导致气道上皮细胞损伤，使其黏膜上皮组织结构改变和功能异常〔12〕。多数研究结果显示，气道上皮细胞可以参与哮踹的慢性气道炎性损伤，受到各种致病菌、过敏原、空气污染和病毒等因素的影响〔13～15〕。Bcl-2、Bax是Bcl-2家族是细胞凋亡的两个重要调控基因，Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，Bax可以与Bcl-2结合促进细胞的凋亡〔16〕。脂质过氧化反应中MDA可以直接反映支气管上皮细胞的损伤程度，抗氧化物SOD和GSH-Px可以保护机体组织避免氧化应激损伤〔17〕。MDA、SOD和GSH-Px可以作为氧化反应的指标，有研究发现，RSV感染细胞后导致体内氧化应激水平失调，加快肺部炎症损伤〔6〕。RSV在支气管上皮细胞中诱导促炎性因子的释放，进而加重哮喘的炎症反应〔18〕。研究结果发现，RSV感染支气管上皮细胞后可以引起细胞凋亡，导致炎性损伤。本研究通过体外培养支气管上皮细胞16HBE，研究结果显示，RAV诱导支气管上皮细胞的凋亡，促进细胞氧化应激和炎症反应，抑制细胞活力。

PTEN在多种癌症中异常表达，在细胞信号转到、凋亡、氧化应激和炎症反应中具有重要的作用〔19,20〕，在支气管上皮细胞、中性粒细胞和气道上皮细胞等多种细胞中发现PTEN可以参与呼吸系统疾病的发生与发展〔21～23〕。由于PTEN自身特有生物活性可以参与多种细胞的生理发展，如诱导细胞凋亡、抑制细胞的增殖和血管生成等〔24〕。有研究发现，PTEN在哮喘中异常表达，同时也发现在其他呼吸系统疾病中PTEN表达异常，如肺炎等〔25,26〕。本研究结果显示，RSV感染支气管上皮细胞PTEN mRNA和蛋白水平表达下调，过表达PTEN可以降低RSV诱导的支气管上皮细胞的凋亡、氧化应激和炎症反应，促进细胞活力，起到保护支气管上皮细胞的作用。

综上，PTEN在RSV诱导支气管上皮细胞后表达下调，过表达的PTEN可以促进支气管上皮细胞的活力，并抑制其细胞凋亡，减缓细胞氧化应激和炎症反应，为临床哮喘治疗提供潜在的作用靶点。