羊水过少孕妇胎盘和胎膜中AQP9和HGF表达及意义

郭金莲 刘 娅 王秀美 卢 红

南通大学附属海安医院(226600)

羊水过少是临床常见妊娠并发症之一[1-2]。羊水过少一方面导致剖宫产率升高，另一方面早产儿及新生儿窒息发生率及围生儿死亡率增加[3]。水通道蛋白(AQPs)是一类促进水转运的低分子跨膜蛋白。研究表明[4]在正常妊娠胎盘和胎膜组织中存有7种水通道蛋白表达，其中AQP9不仅对水、尿素、甘油具有通透性，而且还是氨、腺嘌呤、尿嘧啶及5-FU的通道。AQP9参与妊娠期高血压的病理过程，可能通过线粒体裂殖和触发细胞凋亡过程有关[5]，与羊水量异常关系尚不明确。在胎盘间质细胞中表达的滋养细胞调节蛋白称为肝细胞生长因子(HGF)[6-7]，对胎盘滋养细胞和内皮细胞均有重要调节作用，可促进生理性血管重铸，在胎盘发生、成熟和绒毛血管网建立并刺激细胞分离、增值、迁徙起重要作用[8]；是母婴预后的重要保护因素，通过抑制滋养细胞和内皮细胞凋亡、减少氧自由基聚集来改善胎盘环境，并刺激肺泡Ⅱ型上皮细胞的DNA合成而减少新生儿呼吸窘迫综合征的发生[9-10]。但目前鲜见HGF与羊水量异常的研究报道。本研究通过检测羊水过少产妇胎盘和胎膜AQP9和HGF表达，探讨羊水过少的病因及发病机制。

1 资料和方法

1.1 临床资料

收集2018年8月—2020年10月本院收治的孕妇130例临床资料，其中65例出现羊水过少(病例组)，另外65名例羊水正常(对照组)。孕妇年龄22～36岁，孕周37～40周。两组孕妇均无继发性疾病、宫内感染、吸烟、饮酒、胎儿发育异常、急性绒毛膜羊膜炎、胎膜早破、所用药物包括血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂、非甾体抗炎药等。排除超声证实胎儿异常、胎膜早破、小于胎龄或生长受限胎儿的妊娠；可能影响正常羊水量的其他母体或胎儿疾病，如妊娠或妊娠前糖尿病、高血压疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病等。分娩前实时B超并计算羊水指数(AFI)，AFI≤5.0cm定义为羊水过少，5.0～18.0cm为羊水正常。

1.2 AQP9、HGF mRNA水平测定

胎盘、胎膜组织Trizol分离总RNA。使用随机引物和 M-MLV逆转录酶(200U/ml，Fermentas，Hanover，MD)从2mg RNA合成第一链cDNA。用于cDNA合成的反应混合物由2ml RNA(1mg/ml)和1ml oligo(dT)18引物(0.5mg/ml)和9ml DEPC水组成。70℃ 5min，冰中快速冷却1min，添加：反应缓冲液4ml，dNTP混合物2ml，Rnase抑制剂(20U/ml)1ml，25℃ 5min。加入200U M-MLV逆转录酶1ml。将反应混合物保持在以下循环条件的热循环仪中(25℃ 10min，42℃60 min，70℃10 min)。合成的cDNA储存在20℃。使用PRISM 7500序列检测系统行PCR扩增。AQP9、HGF、GAPDH由上海生工科技合成，序列：AQP9正向引物：5'-TGCGATCGATCGTAGCTAGCTAGC TAGTCGATCGATCG-3'，反向引物：5'-TGCTAGTCGATCGTAGTCGTAGCTAGCTAG TCGTAGCTAGCTGTGTG-3'；HGF正向引物：5'-TGCTGATCGATGCTAGCGCGTAGCTAGTCG ATCGATGCC-3'，反向引物：5'-TGTCGATCGATGCTAGCTAGCTAGCTGATCGATCGATCGAT CGTAGC-3'；GAPDH正向引物：5'-TGTCGATCGTAGCTAGCTAGTCGATCGATCGATGCTAGC TC-3'，反向引物：5'-TGTCAGTCGATCGATGCTAGCTAGTCGATCGATCGATGCTAGC-3'。AQP9、HGF标准化为内部对照GAPDH的含量(-ΔΔCq)。每个样品3次重复分析，计算平均表达水平。PCR反应总体积为25ml，每孔含有1.25ml TaqMan引物和探针(AQP或b-肌动蛋白)、12.5ml TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI)、5ml cDNA模板和6.25ml DEPC H2O。DNA聚合酶的活化在95℃下10 min，然后40个循环，95℃下变性15s和在60℃下退火/延伸1 min。测定均一式3份进行。

1.3 AQP9、HGF蛋白水平测定

免疫组织化学染色。将胎盘胎膜组织室温4%多聚甲醛溶液中固定24h，石蜡包埋，连续切片(厚度4μM)。将切片在0.3%过氧化氢的甲醇中孵育15 min，与1.5%非免疫山羊血清孵育15 min。与抗 AQP9、HGF多克隆兔抗体4℃过夜，以 1:100 稀释，生物素化山羊抗-兔抗体作为二抗，室温孵育 30 min。链霉亲和素过氧化物酶标记20 min，二氨基联苯胺用作色原体 10 min。在程序的每个步骤后用 PBS 洗涤切片，Mayer苏木精复染、脱水并安装在二苯乙烯二甲苯二丁酯中。适当的阳性和阴性对照载玻片平行染色。人肾组织用作阳性对照(免疫染色在不存在一抗的情况下与PBS一起孵育)。AQPs阳性细胞在显微镜下(Olympus-FM10)显示细胞质和(或)细胞膜呈黄褐色染色。对AQP9、HGF染色的强度评分：阴性染色0，弱阳性1，中度积极2，强烈肯定3。染色百分比评分：免疫反应性细胞0%为0，≤5%为1，5%～50%为2，51%～80%为3，> 80%为4。IHC分数乘以染色强度百分比，0～4分为阴性表达，6～12分为阳性表达。

1.4 统计分析

2 结果

2.1 一般情况

两组一般临床资料比较无差异(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般情况比较

2.2 胎盘组织中AQP9 mRNA、HGF mRNA表达

病例组胎盘组织中AQP9 mRNA(1.64±1.74)、HGF mRNA(1.53±1.52)表达水平降低(5.32±0.37、4.69±0.42)(t=13.147、15.641，均P=0.000)；胎盘组织中AQP9(1.36±0.60分)、HGF蛋白表达评分(2.14±0.46分)低于对照组(5.32±0.29分、5.42±0.61分)(t=16.653、17.835，均P=0.000)；胎盘组织中AQP9、HGF蛋白阳性率低于对照组(P<0.05)。见表2、图1(封三)。

表2 两组胎盘组织AQP9、HGF蛋白阳性率比较[例(%)]

2.3 胎膜组织中AQP9mRNA、HGF mRNA表达

病例组胎膜组织中AQP9 mRNA(1.52±1.23)、HGF mRNA(1.85±1.22)表达低于对照组(5.26±0.42、4.42±0.39)(t=16.143、12.583，均P=0.000)；胎膜组织中AQP9(1.85±0.32分)、HGF(2.03±0.21分)表达评分低于对照组(5.03±0.319分、5.10±0.35分)(t=21.468、22.467，均P=0.000)；胎膜组织中AQP9、HGF蛋白阳性率低于对照组(P<0.05)。见表3。图2(封三)。

表3 两组胎膜组织中AQP9、HGF蛋白阳性率比较[例(%)]

3 讨论

胎儿尿液和胎肺是妊娠中晚期生成羊水的主要来源。AQP9广泛存在于哺乳动物，由于它们具有不同的胎膜和胎盘，因此AQP水通道可能/在膜内吸收或胎盘水转移中调节胎儿水流量[11-12]。先前研究发现，在预期羊水过多情况下，如由于胎儿血管容量扩张或羊食管结扎导致胎儿吞咽障碍或外源性液体输注到羊膜腔引起的胎儿多尿，其预期羊水量增加没有发生。相反，胎膜内吸收增加了2～3倍，最终导致正常羊水量变化很小或没有变化[13]。这些研究表明，膜内吸收途径受动态反馈调节，但这些变化的分子机制尚未完全阐明[14]。研究发现相对于正常羊水量妊娠，特发性羊水过多妊娠者羊膜中AQP9表达增加，因此，本研究推测这种增加的膜内流量可能是由AQP9水通道上调引起的在羊膜中表达。本文AQP9在羊水过少和正常羊水量孕妇羊膜、绒毛膜和胎盘中均有表达，与对照组比较，病例组胎盘、胎膜组织中AQP9 mRNA蛋白表达水平及蛋白阳性率均降低，表明AQP9下调可能是一种适应性反应以应对羊水过少。胎盘水流在调节正常羊水量方面可能同样重要，因为大部分胎儿水来自胎盘的母体循环[15]。AQP9表达增加与羊膜及胎盘中水、甘油和尿素渗透性增加相吻合。研究表明，AQP9蛋白定位于滋养层细胞，AQP9可能对调节胎盘水流量有影响，当发生羊水过少时，胎盘中AQP9表达下调以增强水和溶质从母亲到胎儿的运输。

HGF是一种具有血管生成特性的多功能细胞因子，具有促内皮细胞增殖、迁移和新生血管生成的作用。这些功能在胎盘形成中具有潜在重要性，其中滋养层、间充质和血管内皮的增殖和细胞定向是必需的。有研究[16]表明，HGF基因在鼠和羊胎盘中有表达，在人类妊娠足月胎膜中也有表达。在人羊膜中检测到HGF mRNA和蛋白质，在正常足月妊娠的人胎盘滋养层细胞中也发现了HGF表达，表明HGF可能在调节跨胎膜和胎盘的水通量方面发挥重要作用。最近，一些研究探讨了胎膜中HGF的表达与羊水异常关系[17]。转基因HGF基因敲除小鼠后羊水量更低、羊水渗透压更高。HGF表达的降低导致羊水减少[18-20]。本研究结果显示，与对照组比较,病例组胎盘、胎膜组织中HGF mRNA和蛋白表达水平及蛋白阳性率明显降低。使用前列腺素F2a受体(FP)缺陷小鼠建立羊水过少模型，证明发生羊水过少时胎膜中的HGF表达降低，而关于HGF与羊水过少间分子机制关系有待后续研究。

综上所述，AQP9、HGF mRNA和蛋白在羊水过少孕妇胎盘及胎膜中表达降低，提示其可能对母胎液体交换和羊水膜内吸收有重要调控作用。