脐带来源的间充质干细胞对人卵巢皮质异种移植模型血管生成的影响

曹晓敏 刘 丽 邸建永 方 祺 徐凤琴

天津市第一中心医院(300192)

卵巢组织冷冻和移植是一种新兴的女性生育力保护措施，与胚胎冷冻、卵母细胞冷冻相比，该技术具有无法比拟的优势和广阔的应用前景。2004年世界第1例冷冻人卵巢组织经自体移植后获得妊娠、分娩[1]，卵巢移植后其功能仅能维持4～5年，因卵巢移植是非血管吻合的移植存在缺血性损伤、新生血管形成的延迟导致移植后卵泡大量丢失[2]。因此，只有缩短卵巢移植后新生血管形成的潜伏期，减少缺血对卵巢组织造成的损伤，才能延长移植后卵巢存活时间。脐带来源的间充质干细胞(UC-MSCs)是具有高度自我更新和多重分化潜能的成体多功能干细胞，有多种生物学特性，其来源广泛、采集简便、扩增迅速、迁移能力强，并能合成多种细胞因子，调节免疫[3]。动物实验研究证实，UC-MSCs可通过促进血管内皮生长因子(VEGF)的表达改善损伤区域炎症反应；降低干扰素- a(INF-a)表达抑制炎症反应进程，从而促进急性卵巢缺血再灌注损伤小鼠模型新生血管的形成[4]。UC-MSCs分泌的外泌体可通过调节体内激素水平促进卵泡发育,减少卵巢内细胞的凋亡，有效降低化疗对卵巢的损伤,修复卵巢的功能[5]。基于上述理论，本研究旨在探讨卵巢移植时添加UC-MSCs对移植后人类卵巢皮质新生血管生成和卵泡存活的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1卵巢、UC-MSCs及实验动物卵巢组织来自中国公民逝世后捐赠。UC-MSCs来源于足月产妇，经天津市第一中心医院医学伦理委员会批准，并获得产妇的知情同意，经过中国医学科学院移植医学重点实验室完成提取，流式细胞技术检测UC-MSCs表面标志、形态和定向分化的鉴定，UC-MSCs传代3次达到足够数量时用于移植时使用。5～6周雌性重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠20只，体重(200±20)g,由北京维通利华动物公司提供。动物饲养条件：温度(22±2)℃，湿度50%～65%，光照周期12h:12h，独立通风系统，标准饲料，自由进食饮水。

1.1.2主要试剂L-DMEM和RPMI 1640培养基及胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司；凋亡检测试剂盒购于美国Promega公司；Anti-CD34 antibody购于中国Abcam公司；胰蛋白酶K购于德国Merck公司；抗人CD73,CD90,CD105,CD34,CD35单抗购于上海弗元生物公司。

1.2 方法

1.2.1UC-MSCs的分离、培养和鉴定见参考文献[6]。

1.2.2人卵巢皮质的异种移植SCID小鼠给予5%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射，20min后将麻醉小鼠四肢固定于手术操作板上，酒精棉签消毒背部皮肤2次，于两侧髂骨连线中点处纵行切开皮肤1cm，小心分离皮下筋膜，将复苏的人卵巢组织块塞入皮下，皮质面贴于表皮下，髓面贴于皮下筋膜，每只小鼠随机移植4块组织(2mm×2mm),正方形排列，中间留有空隙。缝合皮肤，待小鼠清醒后放于笼中饲养。卵巢皮质移植组(对照组)移植卵巢皮质+10μl 基质胶。卵巢皮质和干细胞移植组(UC-MSCs组)：37℃培养箱中取出准备好的干细胞，微量移液器吸取10μl内含5×105间充质干细胞的基底膜基质胶，均匀的涂抹于皮质片的表面。

1.2.3形态学分析(HE染色)卵巢移植后3，7，14d颈椎脱臼法处死小鼠，从背部原切口处取出移植卵巢组织，经常规脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，5μm厚度连续切片，取间隔10张的组织切片行苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察始基卵泡形态，计数卵母细胞核深染的卵泡。形态分析参照Gougeon提出的标准[6]。

1.2.4凋亡测定(TUNEL法)卵巢移植后3，7，14d颈椎脱臼法处死小鼠，从原切口取出移植卵巢组织，经常规脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，按5μm厚度连续切片，取间隔10张组织切片进行TUNEL染色。按照Promega DeadEndTM凋亡荧光检测系统(Fluorometric Tunel system)检测试剂盒说明书操作。

1.2.5免疫组织化学分析组织标本经常规处理、切片，脱蜡至水，微波抗原修复， 3%(v/v)H2O2阻断内源性过氧化物酶，一抗按1：100用抗体稀释液稀释，4℃孵育过夜，二抗室温孵育30 min，二氨基联苯胺法(DAB)显色，苏木素复染，二甲苯透明。已知阳性的组织作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗为阴性对照。微血管判定及MVD计数方法参照文献[7]：每张切片先在低倍(100倍)视野镜中选出血管最丰富的3个区域，再400倍视野下计数微血管3次取均值。凡被染成棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇的作为一个血管计数，管腔结构形成不作为判定的必要条件。

1.2.6移植卵巢在体局部的血液灌注量检测激光微循环血流成像仪(PeriCamPSI 瑞典)监测整个微循环系统的血液灌注量。实验环境温度(25±0.5)℃，恒湿度(50±10)%下进行。检测卵巢皮质移植后3,7,14d局部血流灌注量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 UC-MSCs的鉴定

倒置显微镜下UC-MSCs细胞呈长梭形，且形态均一，呈旋涡状或平行贴壁生长，细胞排列整齐有序，见图1(1210页)。流式细胞仪仪检测UC-MSCs细胞表面分子标志物CD73、CD90、CD105阳性细胞比例>95%，CD34、CD45阳性细胞比例<2%视为高纯度间充质干细胞，见图2(1210页)。

2.2 移植后卵巢组织形态学分析

卵巢移植后3d dUC-MSCs组与对照组卵巢组织中形态正常卵泡数目无差别(61.5%、62.4%)(χ2=0.02,P>0.05)，移植后7，14d UC-MSCs组均高于对照组(50.2%、38.5%)(χ2=5.55，P<0.05)；(5.4%、34.0%)(χ2=7.43，P<0.05)。见图3(1210页)。

2.3 移植后卵巢组织内细胞凋亡

移植后第3天 UC-MSCs组与对照组卵巢组织中发生凋亡的卵泡比率无差别(12.3%、13.5%)(χ2=0.06，P>0.05)，移植后7，14d UC-MSCs组低于对照组(19.0%、27.2%)(χ2=3.79，P<0.05)； (31.5%、46.3%)(χ2=46.1，P<0.05)。见图4(1211页)。

2.4 在体移植物局部血管生成的免疫组化分析

卵巢皮质移植后3，7，14d UC-MSCs组卵巢微血管密度高于对照组[(3.7±0.9)% 、(1.8±0.4)%,(t=19.29,P<0.05)；(6.6±0.9)%、(3.1±1.1)%，(t=24.63,P<0.05)；(8.9±1.5 )%、(4.2±1.7)%,(t=20.73,P<0.05)]。见图5(1211页)。

2.5 在体局部移植物血液灌注量

移植卵巢在体局部血液灌注量检测结果见图6(1211页)。卵巢皮质移植后3d ，UC-MSCs组和对照组移植物局部血流灌流量无差别[(46.4±13.5)PU、(47.4±15.1)PU](t=0.14,P>0.05)，移植后7d UC-MSCs组高于对照组[(106.4±12.2)PU、(87.8±11.9)PU](t=2.44,P<0.05)，移植后14d UC-MSCs组移植物局部的灌流高于对照组[(124.5±18.4)PU、(99.3±16.6)PU](t=2.27,P<0.05)。两组微循环灌流量均随移植时间长而增加。

3 讨论

卵巢组织复苏自体移植后的成活情况是决定生育力能否恢复的关键，目前移植后存活的卵巢组织功能维持时间并不理想，因为卵巢皮质块在移植后几天内一直处于局部无血管的缺血缺氧状态，这种状态持续3～5d，可导致移植后卵泡大量的丢失，丢失率高达60%～80%[8]。UC-MSCs是一类具有干细胞特征的细胞群体,有体内外扩增培养和多向分化的潜能。近年来干细胞在再生医学领域的大量应用并取得了许多成果，国内研究报道骨髓间充质干细胞不仅可以分化为心肌细胞和血管细胞，还可以分泌大量的生长因子和细胞因子，并以旁分泌的方式诱导新生血管形成、抗炎症、抗凋亡等，减小急性心肌梗死面积，减少瘢痕形成，改善心功能[9]。在急性卵巢缺血再灌注损伤动物模型上UC-MSCs可促进受损卵巢组织恢复功能和血，减少卵泡受损[10]。研究证实，移植人工卵巢模型中可显示宿主内皮细胞的血管化[11-12]。基于此，本研究试图通过选用UC-MSCs促进小鼠血管再生重建，降低卵巢皮质移植后因缺血导致的卵泡大量丢失。本研究选择3个具有代表性的时间点，分别为移植后的第3，7和14d，分析UC-MSCs对移植后早期、中期和晚期血管生成的影响。通过免疫标记小鼠来源的CD34抗原，评价移植皮片局部的血管化。移植后7，14d UC-MSCs组卵巢微血管密度显著高于对照组，提示UC-MSCs使移植皮质的血管化提前。其机制可能是脐带来源的UC-MSCs分化为内皮细胞和各种血管生成因子促进新生血管的形成。也可能是MSCs通过分泌生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF2)、肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、血小板衍生生长因子(PDGFB)、转化生长因子β(TGF-β)和血管生成素等，促进血管形成。本研究下一步工作是设计实验验证上述假设。

考虑到形态学分析在评估血管生成的局限性，本研究通过测量移植物局部的血流量这一反应血管生成的可靠指标进行深入探讨，并首次引入了激光微循环血流成像仪检测移植物局部的微循环血流量的变化，此方法无创、分辨率高、超快采样易于捕捉血流实时变化。由于环境温度、湿度可能影响测量结果的准确性，因此本实验在恒温恒湿的屏障系统内完成避免了环境因素对实验结果的干扰。既往的研究报道UC-MSCs在第3天对血管生成有显著的诱导作用[13]，本研究在这一时间点两组移植局部的血液灌注量没有明显差别，UC-MSCs组的初始血流灌注增加发生在移植后第7天。这种延迟血液灌注现象可能是新的微血管网络在早期没有获得血液供应的功能，而是到成熟一定时期后，新生的血管才可以产生血液灌注。另一方面，移植后第3天形态正常的原始卵泡比例两组之间无差别，在第7天后，UC-MSCs组形态正常的原始卵泡比例较对照组明显增加，因此，推测UC-MSCs增加的移植物微血管化、改善卵泡存活，只有在移植物已经恢复血供后才能发挥作用，与组织学血管生成无关。多数文献报道移植后卵泡平均存活率仅25%[14-15]。本研究UC-MSCs组移植14d形态正常的卵泡比例达到46%，证实了UC-MSCs通过改善移植物局部微循环，减少卵泡损失的假设。本研究中移植后两组的细胞凋亡率均有所增加，但移植后第7天和第14天UC-MSCs组比对照组卵泡凋亡率明显降低。可能与UC-MSCs加速移植物微循环重建、较早恢复局部氧供，降低了低氧对移植物的损伤，从而使得卵泡闭锁率减少所致。

总之卵巢组织移植时使用UC-MSCs动物模型的实验结果是令人鼓舞的，UC-MSCs可以使卵巢组织的血管化提前，细胞凋亡减少。未来的工作将侧重于阐明UC-MSCs在卵巢移植后微循环重建过程中发挥作用的各种机制研究。