猪肌肉多发性脓肿病原菌的分离鉴定及药敏试验

李康健 ， 赵贤杰 ， 郭敏仪 ， 付 强，3 ， 马春全，3

(1. 佛山科学技术学院生命科学与工程学院 ， 广东 佛山 528225 ； 2. 佛山科学技术学院大学科技园 ，广东 佛山 528225 ； 3. 佛山佛科院动物医院有限公司 ， 广东 佛山 528225)

猪脓肿是猪场中常见的多发病，多见单一肿块脓包。哺乳仔猪的脓肿多发于脐部，中大猪和种猪的脓肿多发于颈部，该现象主要是由药物、疫苗等不规范注射引起的。猪多发性脓肿在临床上比较少见，主要是因皮肤或黏膜损伤，化脓性病原菌直接侵入体内并大量繁殖造成的，也可由原发性病灶经血液或淋巴循环转移至新的组织器官而产生[1-2]。其特征是在猪肌肉形成外有脓肿膜包囊，内有浓汁潴留的局限性脓腔。脓肿膜包囊内的致病菌容易扩散，常可形成局部溃疡、组织坏死等并发症[3]。猪肉脓肿的常见病原菌有葡萄球菌、链球菌、伯克氏菌、气单胞菌以及化脓性棒状杆菌等[4-6]。其中多数致病菌可感染人，引起食物中毒等严重后果，威胁我国的食品卫生安全[7]。本试验发现的猪肌肉多发性脓肿分布于全身肌肉，但眼观体征无异常，屠宰过程中才被发现。因此，本试验对该病例进行了病原菌分离鉴定、药敏试验和组织病理学观察，为类似的猪多发性脓肿的诊治和鉴别提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料样品 猪肌肉多发性脓肿病料采集自广东某大型养殖场。该猪肌肉多发性脓肿分布于全身肌肉，屠宰前体征无异常，屠宰过程中才被发现，同批次屠宰猪发病率为3%。

1.2 主要试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒、2×ExTaqDNA聚合酶、DL-2 000 DNA Marker、载体pMD19-T、感受态细胞DH5α，均购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA凝胶回收试剂盒，购自Axygen公司；异丙醇、无水乙醇、氯仿等试剂均为分析纯，购自广州鼎国生物技术有限公司；革兰染色试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA培养基)、胰酪大豆胨液体培养基(TSB培养基)、药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司；微生物微量生化鉴定管，购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 病原菌的分离鉴定 无菌条件下，切开脓肿囊膜，使用无菌、洁净的接种环蘸取脓汁，并重复划线于TSA琼脂平板，37 ℃恒温培养12 h，待平板上长出菌落后，挑取单菌落进行革兰染色。

1.3.2 病原菌16S rDNA扩增 首先使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌全基因组，并以其为模板，使用16S rDNA通用引物对进行PCR扩增[16S-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和16S-R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]。扩增体系为50 μL，PCR反应条件：95 ℃预变性，5 min后进入循环；94 ℃ 40 s、55 ℃ 35 s、72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 延伸10 min。将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3 16S rDNA的克隆与序列分析 PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒回收后克隆至载体pMD19-T中，再转化至感受态细胞DH5α中，经培养，挑取单个菌落进行鉴定，获得的重组阳性质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序获得的16S rDNA基因序列在NCBI上进行序列比对，并用MEGA 7.0软件进行系统进化树分析。

1.3.4 生化试验 将获得的菌株进行生化试验，包括葡萄糖、蔗糖、鼠李糖等糖发酵试验，V-P试验，硝酸盐还原试验，试验步骤按说明书进行。

1.3.5 药敏试验 试验选取临床上较为常用的14种抗菌药物，运用纸片扩散法，在固体培养基上涂满获得的分离菌株并将药物纸片置于上面，放置在37 ℃恒温培养箱培养12～48 h。根据抑菌圈的大小将细菌分为敏感(S)、中度敏感(I)和耐药(R)，结果判读参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)2015年[8]中规定进行。

1.3.6 组织病理学石蜡切片制作 参照参考文献[9]方法对病灶进行病理切片制作，取脓肿病料通过固定、流水冲洗、脱水、包埋、切片、染色、镜检等过程制备组织切片,用以观察病料的病理组织变化。

2 结果

2.1 病原菌的分离与鉴定 采集猪肌肉多发性脓肿病料(图1)，将脓汁划线接种于TSA琼脂平板上，经37 ℃恒温培养12 h，在琼脂平板上形成白色隆起、湿润、光滑、不透明的直径2～3 mm圆形菌落(图2)。涂片进行革兰染色，镜检可见大量革兰阳性、短链状或葡萄串状的球菌(图3)。

图1 猪肌肉多发性脓肿病灶Fig.1 Multiple abscess foci between the pig muscles

图2 分离菌在普通琼脂培养基上生长Fig.2 Bacterial isolate grown on agar medium

图3 病原菌革兰染色结果 (1 000×)Fig.3 Gram staining results of pathogenic bacteria (1 000×)

2.2 16S rDNA基因的序列分析 应用MEGA 7.0软件，将获得的分离菌株16S rDNA基因序列与8株葡萄球菌参考株的16S rDNA基因序列进行比对，并构建系统进化树(图4)。结果显示，本试验分离得到的葡萄球菌(Staphylococcussp. SG00263)与巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuris)处于同一进化分支上，亲缘关系最为接近。

图4 基于16S rDNA的葡萄球菌系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of staphylococci based on 16S rDNA▲：本试验分离菌株▲:The strain isolated in this test

2.3 生化试验 将分离菌株进行生化试验，结果如表1所示，该分离菌株可发酵麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和松二糖，不能发酵木糖、乳糖和阿拉伯糖等；同时，分离菌株还能够还原硝酸盐，V-P试验测定为阳性。

表1 生化试验结果Table 1 Results of biochemical test

2.4 药敏试验 使用14种猪场常用抗菌药物对该分离菌株进行药敏试验，结果如表2所示，该菌株主要对β-内酰胺类药物耐药，如青霉素、氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄等；对部分氨基糖苷类药物耐药，如万古霉素；对部分氨基糖苷类药物敏感，如大观霉素；对链霉素中度敏感；对磺胺类药物耐药；对四环素类、喹诺酮类药物等敏感。

表2 药敏试验结果Table 2 Results of drug sensitive test

2.5 组织病理石蜡切片观察 取猪肌肉脓肿病料，制作病理石蜡切片。切片观察发现，猪肌肉脓肿病灶中有大量淋巴细胞、中性粒细胞及其他炎症细胞浸润，病灶与正常组织界限不明显，见图5。

图5 猪脓肿病灶病理切片(H.E.染色，A：40×；B：400×)Fig.5 Pathological section of pig abscess (H.E. staining，A:40×；B:400×)红色箭头：淋巴细胞浸润 Red arrow:Lymphocyte infiltrations

3 讨论

猪脓肿是大型猪场中常见的一种外科疾病，但关于该病的报道在我国相对较少。近期仅有张天天等[10]在贵州某猪场的猪体表脓肿中分离出金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌等病原菌的报道。而本试验发现一病猪肌肉间多发性脓肿病例，国内尚未见报道。肌肉间多发性脓肿可以通过2种途径实现——直接通过创口和注射部位感染和血源性感染[11]。本试验通过组织病理学分析发现，病灶处的肌肉既有较大的脓肿灶，也有很小的病灶，且病灶与正常组织间界限不明显，具有一定的蜂窝织炎特点，与常见的普通脓肿有很大差异。而除肌肉外的其他内脏器官未见化脓灶，表明该病原菌主要通过肌膜扩散，提示该病例的出现可能与疫苗注射过程操作不规范有关。

巴氏葡萄球菌是一种人兽共患的病原菌，可引起多种局部或全身性的感染疾病[12-13]，但其引起的猪的疾病却未见报道。本试验使用病例脓汁进行了病原菌分离鉴定，经系统进化树分析其是1株巴氏葡萄球菌。葡萄球菌具有产透明质酸酶特性，该酶能溶解肌膜，使化脓性病灶沿着肌膜鞘扩散。本试验发现的猪肌肉多发性脓肿分布于全身肌肉的病理特点，可能与该菌株的产透明质酸酶特性有关。另外，药敏试验结果表明该菌株耐药性强，对多数临床常用抗生素均耐药，也是该批次猪肉发病比例较高的重要原因之一。

本试验从一猪肌肉多发性脓肿病例中分离出1株巴氏葡萄球菌，并对该菌进行了药敏试验、生化试验和组织病理学分析。肌肉多发性脓肿及其病原菌的鉴定在国内尚未见报道，因此，本试验对肌肉多发性脓肿的检测及诊断具有临床指导意义，有助于提高我国的食品卫生安全水平。