猫源伪中间葡萄球菌耐药性调查

张海霞 ， 雷 蕾,2 ， 张振彪 ， 代禾根 , 李 蕾 ， 宋 昱 ， 夏兆飞

(1. 中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 浙江农林大学动物科技学院·动物医学院 ， 浙江 杭州 311300)

伪中间葡萄球菌(Staphylococcuspseudintermedius)是由Devriese等于2005年命名的一种凝固酶阳性葡萄球菌[1]。作为一种共生条件致病菌，伪中间葡萄球菌可导致患猫发生外耳炎、膀胱炎、脓肿、创伤和皮肤感染等[2-4]。目前，已有大量关于宠物源(尤其是犬源)耐甲氧西林伪中间葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcuspseudintermedius,MRSP)的研究[2,5-8]。但国内外单独关于猫源伪中间葡萄球菌的耐药性调查均较少。国内外有关猫源MRSP的相关报道更为罕见[4,9]。本试验旨在调查猫源临床样本中伪中间葡萄球菌的耐药情况，为猫源伪中间葡萄球菌的耐药性监测提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集和细菌分离 2017年11月—2019年4月收集1 990份送检至中国农业大学动物医院检验科和第三方检测机构的猫源临床样本，接种于5%绵羊血琼脂平板、麦康凯琼脂平板和甘露醇氯化钠琼脂平板中，37 ℃恒温培养24 h，观察菌落形态特征，初步筛选出葡萄球菌。

1.2 16S rDNA基因测序和mecA基因检测 使用Magen HiPure Bacterial DNA试剂盒提取制备细菌DNA模板，贮存于-20 ℃备用。使用16S rDNA基因通用引物进行PCR扩增，将所获得的序列在NCBI网站上进行BLAST比对，鉴定细菌种属(同源性>99%)。使用合成的特异性引物[10]扩增mecA基因，检测出mecA基因的菌株为耐甲氧西林伪中间葡萄球菌[11]。

1.3 药物敏感性试验 依据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)标准和临床常用药物选用10类共14种抗菌药。苯唑西林、青霉素、万古霉素、克林霉素、阿米卡星、庆大霉素、利福平、多西环素、氯霉素和阿奇霉素，均购自中国食品药品检定研究院；氟苯尼考、恩诺沙星和环丙沙星，均购自北京索莱宝科技有限公司；利奈唑胺，购自上海源叶生物科技有限公司。采用琼脂稀释法进行药物敏感性试验，测定最小抑菌浓度(Minimal inhibit concentration,MIC)。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 29213。药敏结果判定标准参照CLSI VET08和CLSI 2018 M100。对3类及3类以上药物产生耐药定义为多重耐药[12]。

1.4 数据分析 采用R 4.0.2软件进行χ2检验和Fisher精确检验，以P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 伪中间葡萄球菌分离鉴定 经甘露醇氯化钠琼脂培养基筛选葡萄球菌后，16S rDNA引物扩增电泳获得目的条带为1 465 bp的PCR产物(图1)。将PCR产物测序拼接后，在NCBI数据库中进行BLAST比对，与伪中间葡萄球菌的序列同源性达99%～100%。本试验共采集来自临床患猫的样本1 990份，分离鉴定获得伪中间葡萄球菌49株(分离率为2.5%，95%CI：1.8～3.2，n=49/1 990)。

2.2 细菌来源mecA基因检测结果显示，34株(69.4%，n=34/49)为MRSP，15株(30.6%，n=15/49)为甲氧西林敏感伪中间葡萄球菌(Methicillin-susceptibleStaphylococcuspseudintermedius,MSSP)。MRSP和MSSP的总体分离率分别为1.7%(95%CI：1.2～2.4，n=34/1 990)和0.8%(95%CI：0.4～1.2，n=15/1 990)。49株伪中间葡萄球菌的来源分布见图2，包括尿液(57.14%，n=28)、耳道(16.33%，n=8)、鼻腔(6.12%，n=3)、脓肿(6.12%，n=3)、骨骼(4.08%，n=2)、创口(4.08%，n=2)、皮肤(2.04%，n=1)、口腔(2.04%，n=1)和体腔液(2.04%，n=1)。经统计学分析，在细菌来源方面，MRSP和MSSP之间无显著差异(P>0.05)。

图2 不同感染部位分离伪中间葡萄球菌的数量Fig.2 Number of Staphylococcus pseudintermedius isolates from different infection sites

2.3 动物特征 49株伪中间葡萄球菌分离自49只患猫的临床样本中。其中，29只(59.18%)来自北京市，6只(12.24%)来自广东省，上海市和辽宁省各3只(6.12%)，山西省、山东省和福建省各2只(4.08%)，江苏省和天津市各1只(2.04%)；性别分布：雌性13只(26.53%)，雄性35只(71.43%)，性别未知1只(2.04%)；品种分布：英国短毛猫11只(22.45%)，家养短毛猫13只(26.53%)，美国短毛猫4只(8.16%)，异国短毛猫5只(10.20%)，布偶猫和家养长毛猫各2只(4.08%)，暹罗猫、金吉拉猫、阿比西尼亚猫和苏格兰折耳猫各1只(2.04%)，品种未知8只(16.33%)；年龄范围：除3只年龄未知外，均介于3～192月龄。经统计学分析，在品种和性别方面，MRSP和MSSP之间均无显著差异(P>0.05)。

2.4 药物敏感性试验 49株伪中间葡萄球菌对青霉素、克林霉素、阿奇霉素、多西环素、环丙沙星、恩诺沙星、苯唑西林和氯霉素高度耐药，耐药率介于53.1%～100.0%；对氟苯尼考和庆大霉素较敏感；对利奈唑胺、万古霉素、阿米卡星和利福平敏感(表1和表2)。MRSP对青霉素和多西环素的耐药率均高达100.0%。MSSP对青霉素、克林霉素、阿奇霉素、氯霉素和多西环素的耐药率均为60.0%以上。MRSP对4种抗菌药物的耐药率与MSSP呈显著差异(P<0.05)(表1)。3株MRSP对苯唑西林敏感，1株MSSP对苯唑西林耐药。值得注意的是，49株伪中间葡萄球菌的多重耐药率高达100.0%(49/49)，MRSP至少对4种受试药物耐药，MSSP至少对3种受试药物耐药(图3)。

表1 49株伪中间葡萄球菌对14种抗菌药物的耐药率Table 1 Antimicrobial resistance rates of 49 Staphylococcus pseudintermedius isolates

表2 49株伪中间葡萄球菌分离株的MIC分布Table 2 Distribution of the MIC values of 49 Staphylococcus pseudintermedius isolates

图3 伪中间葡萄球菌的多重耐药菌株分布Fig.3 Multidrug resistance distribution of Staphylococcus pseudintermedius isolates

3 讨论

本试验中伪中间葡萄球菌的分离率为2.5%，低于冯言言等报道的华南地区猫源伪中间葡萄球菌的分离率[9]；MRSP的总体分离率为1.7%，低于芬兰和德国的相关报道[2,13]；69.4%的伪中间葡萄球菌为MRSP，高于泰国的相关报道[5]。冯言言等[9]共从采自临床患猫的样本中分离到11株伪中间葡萄球菌，来源于耳道、皮肤和尿液。Kadlec等[4]分离到11株来源于临床患猫的MRSP，涉及的疾病包括败血症、尿道感染、肾炎、鼻炎、创口感染和肺炎。Ruscher等[13]分离到6株猫源MRSP，来源于创口、泌尿道和耳道。本试验中伪中间葡萄球菌主要来源于尿液和耳道，而冯言言等[9]从尿液中仅分离到1株伪中间葡萄球菌(仅采集到1份尿液样本)。国内不同研究中出现的样本来源的不一致性，可能与兽医送检样本进行细菌培养的意识增强相关。

本试验结果显示，伪中间葡萄球菌对青霉素、克林霉素、阿奇霉素、多西环素、环丙沙星、恩诺沙星、苯唑西林和氯霉素高度耐药；对氟苯尼考和庆大霉素较敏感。Saputra等[14]报道13株猫源伪中间葡萄球菌对氯霉素和克林霉素耐药，而对氟喹诺酮类药物敏感。Kadlec等[4]研究发现，大多数MRSP分离株对β内酰胺类药物、大环内酯类药物、氨基糖苷类药物、氟喹诺酮类药物、四环素类药物和氯霉素类药物耐药。Wegener等[6]的研究中有3株MRSP未表现出苯唑西林耐药，耐药表型和耐药基因不一致的情况还需要进一步探索。尤其值得注意的是，本试验中MRSP和MSSP均出现了多重耐药性，而在犬源伪中间葡萄球菌的相关报道中[15]，MRSP的多重耐药率是MSSP的2～3倍。因此，本试验结果表明猫源性伪中间葡萄球菌存在更为严重的耐药现象，应进一步探究背后的原因。

伪中间葡萄球菌的耐药性，尤其是MRSP的耐药性，已经引起了兽医领域研究人员的广泛关注。而猫源伪中间葡萄球菌的相关研究则相对少见。国内猫源伪中间葡萄球菌的分离率高于国外，且MRSP和MSSP均存在多重耐药性的现状，给临床兽医敲响了警钟，提醒临床兽医在工作中应合理选择抗生素，使用抗菌药物之前尽可能采样进行细菌培养和药物敏感性试验，致力于减缓细菌耐药性的发展，维护公共卫生安全。